High-valent iron oxidation states and protein radicals in cytochrome P450 and NO synthases
Final Report Abstract
In den Reaktionszyklen von physiologisch und pharmokologisch relevanten Enzymen der Cytochrom P450-Familie wird eine kurzlebige Zwischenstufe postuliert, deren elektronische Struktur allgemein als ein Fe(IV)=O Porphyrin-π-Kation-Radikal-System angesehen und als Compound I (Cpd I) bezeichnet wird. Die entsprechenden Voruntersuchungen mit Mössbauer- und EPR-Spektroskopie zu diesem Projekt zeigten, daß bei der Reaktion von P450cam mit Persäuren zwar eine intermediäre Fe(IV)-Spezies entsteht, die aber nicht - wie bisher angenommen - mit der Bildung eines Porphyrin-π-Kationradikals, sondern mit der Bildung von proteinbasierten Radikalen einhergeht. Deshalb erfolgten im Rahmen dieses Projekts umfangreiche Stopped- Flow-UV-Vis Studien sowohl am nativen Cytochrom P450cam als auch an der Doppelmutante P450cam Tyr75Phe/Tyr96Phe, letztere mit der Hoffnung Cpd I zu stabilisieren, indem ein möglicher Elektronentransfer von Tyrosylresten auf ein intermediär gebildetes Fe(IV)=O Porphyrin-π- Kation-Radikal-System unterbrochen wird. Allerdings konnte im Fall von P450cam weder in unseren noch in den Untersuchungen amerikanischer Arbeitsgruppen eine für Cpd I charakteristische Bande bei 690 nm experimentell detektiert werden, obwohl eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen (Oxidation mit Peressigsäure als auch m-CPBA bei verschiedenen Temperaturen, in verschiedenen Enzymkonzentrationen und Überschüssen an Oxidans) im Rahmen dieses Projekts untersucht wurden. In jüngster Zeit ist es allerdings einer weiteren amerikanischen Arbeitsgruppe gelungen, Cpd I durch Reaktion eines P450 aus einem themostabilen Bakterium (CYP 119) mit m-CPBA zu stabilisieren und spektroskopisch zu charakterisieren. Der Grund, warum Cpd I insbesondere in unseren Arbeiten an P450cam nicht schlüssig detektiert werden konnte, im Fall von CYP 119 allerdings mit hohen Ausbeuten stabilisiert werden kann, bleibt im Dunkeln. Damit werden zukünftige Studien nicht mehr darauf abzielen festzustellen, ob Cpd I in P450 wirklich als Reaktionsintermediat existiert, sondern welche strukturellen und dynamischen Eigenschaften dafür sorgen, dass Cpd I für spektroskopische Studien stabilisiert werden kann.
Publications
- Intermediates in the reaction of substrate-free cytochrome P450cam with peroxy acetic acid and meta-chloroperbenzoic acid. Annual Meeting of the German Biophysical Society, Bochum 03.-0.6.10.2010
R. Christmann, C. Balluff, F. Hannemann, C. Jung, V. Schünemann
