Imbalance of homologous recombination and DNA replication as a driver of hereditary breast cancer
Human Genetics
Final Report Abstract
Brustkrebs ist die am die häufigsten diagnostizierte Krebsart bei Frauen. Heterozygote Träger*innen pathogener Varianten in Genen, die für die homologe Rekombination (HR) wichtig sind wie BRCA1/2, PALB2 und ABRAXAS1, haben ein hohes Risiko, frühzeitig und häufig zu erkranken. Das allgemein akzeptierte Modell ist, dass der Verlust der Heterozygotie (LOH) des funktionellen Allels eine stark erhöhte und früh einsetzende Tumorigenese verursacht. Mehrere Beobachtungen weisen darauf hin, dass bereits eine Haploinsuffizienz ausreichend für den Prozess der Tumorigenese ist. Daraus ergab sich die Arbeitshypothese, dass bereits eine moderate Reduktion an HR-Protein ausreicht, um die Funktionalität des HR-Komplexes während der DNA-Replikation zu stören und die genomische Instabilität voranzutreiben. Zur Klärung dieser Frage wurden die molekularen Mechanismen, welche durch Genome Editierung bzw. prädisponierende Mutationen zu einem reduzierten HR-Proteinspiegel und daraus folgend zu genomischer Instabilität führen, charakterisiert. Es wurden klonale Zelllinien mit ein/zwei inaktivierten Kopien der drei BRCA1 Allele und analog isogene Klone mit ein/zwei/drei der vier aktiven BRCA2 Allele der MCF7 Zelllinie hergestellt. Ein vitaler vollständiger Knock-out war für beide Gene nicht möglich. ABRAXAS1 und PALB2 wurden an Lymphoblastoiden von Brustkrebskohorten mit heterozygoten, pathogenen Mutationen untersucht. BRCA1-Klone zeigten nahezu alle eine signifikant verringerte HR-Kapazität. Der BRCA1-Klon mit der geringsten HR-Kapazität wies vermehrt RAD51 und γH2AX Foci auf und daraus resultierend häufiger Anaphase-Brücken und Mikrokerne nach MMC. Die Wachstumsraten wurden Exon-abhängig beeinflusst: forciert durch Modifizierung von Exon 9 mit einer kürzeren S-Phase und verlangsamt durch Exon 14 Editierung. Analysen zum zellulären Überleben zeigten, dass Exon 14 abhängig eher eine Sensibilisierung und Exon 9 abhängig eine Resistenzbildung nach Schädigung in der S-Phase auftrat (MMC, PARP1i, γ-Bestrahlung). Die veränderte BRCA1 Expression wirkte sich auch auf die Expression von FANCD2 und CHK1 aus. Dies, gemeinsam mit der reduzierten HR-Kapazität, deutet auf eine veränderte DNA-Schadensantwort und geringere Rekrutierung von DNA-Reparaturfaktoren in der S-Phase hin und wird durch eine geringere Reduktion der DNA-Replikationsgeschwindigkeit im resistentesten und vice versa im sensibelsten bestätigt. Eine wegweisende Beobachtung war, dass einzelne BRCA1-Subklone morphologisch eine Veränderung vom epithelialen zum mesenchymalen Phänotyp aufwiesen, ersichtlich anhand einer veränderten Expression der Stammzellfaktoren ZEB1, E-Cadherin und ALDH1A. Dies wurde in BRCA1-Klonen mit zwei aktiven Allelen ebenfalls durch einen signifikant erhöhten Anteil an ALDH1 positiven Zellen bestätigt. Daher scheint eine Veränderung der Zellplastizität in Abhängigkeit zu einer optimalen BRCA1 Gendosis zu stehen. Funktionelle Untersuchungen an LCLs von ABRAXAS1 Mutationsträger*innen mit der finnischen pathogenen Gründervariante ABRAXAS1 c.1082G>A (Arg361Gln) zeigten, dass bereits der heterozygote Zustand zu einer signifikant verringerten Dosis an BRCA1-Protein führte, welches darüber hinaus teilweise im Zytoplasma zurückgehalten wurde. Dies ging einher mit einer verringerten Focibildung von BRCA1 und CtIP. Diese Defizite der Zellen führten zu einer geringeren Kapazität von Resektions-abhängigen DNA Doppelstrangbruchreparaturwegen, einer abgeschwächten DNA-Schadensantwort sowie einem fehlregulierten G2-M Kontrollpunkt. Dadurch übte die finnische ABRAXAS1-Mutation einen dominant-negativen Einfluss auf BRCA1 aus, welcher zu einer Genomdestabilisierung führte und damit die Tumorgenese förderte. Ursächlich dafür scheint eine transkriptionelle Fehlregulation in Träger*innen zu sein. Zusammenfassend zeigte sich, dass durch die Generierung der isogenen Zellmodelle mit gradueller Inaktivierung von BRCA1 und BRCA2 wertvolle Forschungswerkzeuge etabliert wurden, welche die Adressierung der Hauptziele des Projektes ermöglichten. Herauszustellen ist, dass es für bestimmte Phänotypen, wie z.B. Plastizität und Resistenzbildung eine optimale Dosis des BRCA1 und BRCA2-Proteins zu geben scheint. Andere Phänotypen, insbesondere DNA-Replikationsstress treten erst unterhalb eines kritischen Schwellenwertes der Proteine auf. Daher bietet sich die Bestimmung der Proteinmenge von HR-Faktoren gemeinsam mit der funktionalen Analyse des DNA-Replikationsstresses als Marker für das Brustkrebsrisiko an. Für Aussagen zu Prognose und Therapieresistenz müsste die Bedeutung von HR-Faktoren für Plastizität, Resistenzbildung und zellulärer Immunantwort berücksichtigt werden.
Publications
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