The role of mitochondria for molybdenum cofactor biosynthesis
Final Report Abstract
In der ersten Förderperiode dieses Projektes konnte gezeigt werden, dass die Biosynthese des Molybdäncofaktors (Moco), der als prosthetische Gruppe essenziell für die sogenannten Molybdoenzyme ist, in den Mitochondrien beginnt und nach Export des ersten Zwischenproduktes, cPMP, im Cytosol abgeschlossen wird. Hierbei wurde die Beteiligung des mitochondrialen ABC-Half Size- Transporters ATM3 am Export von cPMP aus den Mitochondrien in das Cytosol postuliert, da Arabidopsis atm3-Mutanten cPMP in den Mitochondrien akkumulieren, während die Gehalte an Moco sowie die Aktivitäten der davon abhängigen Molybdoenzyme reduziert sind. Eine Funktion von ATM3 innerhalb der Moco-Biosynthese war insofern überraschend, als dass ATM3 bis dahin allein als Exporter eines Schwefel-haltigen, wahrscheinlich Glutathion-artigen Moleküls galt, welches als Substrat für die Assemblierung von Eisen-Schwefel(FeS)-Clustern im Cytosol dient. Interessanterweise zeigen atm3-Mutanten Restaktivitäten aller von extra-mitochondrialen FeS-Clustern abhängigen und unabhängigen Molybdoenzyme, so dass die Existenz weiterer mehr oder weniger spezifischer Transport-Mechanismen sowohl für cPMP als auch für die unbekannte Schwefel-haltige FeS-Vorstufe angenommen werden mußte. In der zweiten Förderperiode dieses Projektes wurden zunächst die Arabidopsis atm3-Mutanten auch im Hinblick auf eine Entwicklungsabhängigkeit ihres Phänotyps untersucht, wobei sich gezeigt hat, dass die zuvor gemachten Beobachtungen zwar für bis zu 5 Wochen alte Pflanzen Gültigkeit besitzen, atm3-Mutanten höheren Alters jedoch z.T. höhere Molybdoenzym-Aktivitäten als Wildtypen besitzen und keine cPMP-Akkumulation mehr aufweisen. Somit ist eine Beteiligung von ATM3 an der Moco- Synthese zu frühen Zeitpunkten der pflanzlichen Entwicklung zwar eindeutig, jedoch kann ATM3 keinesfalls allein für den Export der Moco-Vorstufe cPMP verantwortlich sein. Im Hinblick darauf wurde geprüft, ob ein Transport von cPMP als direktes Substrat durch ATM3 überhaupt nachweisbar ist, wozu rekombinantes ATM3-Protein im Bakterium Lactococcus lactis hergestellt wurde. Wenn auch schlecht reproduzierbar und mit nur geringen Ausbeuten herzustellen, besaß das rekombinante ATM3-Protein die typische Temperatur-abhängige und Vanadat-sensitive ATPase-Aktivität. Allerdings konnte weder mit cPMP als alleinigem Substrat noch mit Glutathion als Co-Substrat ein Hinweis auf eine Transport-Aktivität erhalten werden. Dies bestätigend wurde auch durch Behandlung von Arabidopsis-Pflanzen mit dem Glutathion-Synthese-Hemmer Buthioninsulfoximin eine Beteiligung von Glutathion an der Moco-Synthese ausgeschlossen. Demnach ist cPMP als direktes Substrat für ATM3 eher auszuschließen und könnte nur - sofern es überhaupt durch ATM3 transportiert wird - mit einem anderen Co-Substrat als Glutathion transportiert werden. Im Wesentlichen decken sich diese Erkenntnisse daher mit der vorherigen Beobachtung an atm3-Mutanten, wonach andere Mechanismen zum Export von cPMP aus den Mitochondrien ins Cytosol vorhanden sein müssen. Um einen Einblick in derartige Mechanismen zu erlangen wurde der erste und mitochondriale Schritt der Moco-Synthese in der Molybdän-Stoffwechsel-freien Hefe Saccharomyces cerevisiae nachgebildet. Dazu wurden die Gene Cnx2 und Cnx3 aus der Molybdän-Stoffwechsel-besitzenden Hefe Pichia pastoris in S. cerevisiae eingebracht und nach Induktion ihrer Expression die Synthese von cPMP durch Akkumulation im Cytosol von S. cerevisiae nachgewiesen. Damit konnte zum einen gezeigt werden, dass S. cerevisiae die notwendigen Komponenten für den Export von cPMP besitzt, wobei abgesehen vom ATM3-Homolog Atm1p diese Komponenten jedoch unbekannt sind. Zum anderen ergibt sich daraus die Möglichkeit, die Funktion des Hefe-eigenen Transporters Atm1p und die von ATM3 anhand von atm1-Mutanten (± ATM3) zu studieren sowie die nachfolgenden Schritte der Moco- Synthese einzubringen, um weitere fundamentale Fragen zu klären. Als neuer Bestandteil des Projektes wurde die Interaktion der Metabolismen von Molybdän und Eisen an Cucumis sativus- Keimlingen untersucht und dabei gefunden, dass eine Molybdän-Defizienz eine drastische mitochondriale Eisen-Akkumulation und umgekehrt eine Eisen-Defizienz eine mitochondriale Molybdän-Akkumulation bewirkt. Diese wechselseitige Beeinflussung setzt sich auf Ebene der Molybdoenzym-Aktivitäten sowie auf die Moco-Biosynthese fort, wobei letztere bemerkenswerterweise durch Molybdän-Defizienz nicht beeinträchtigt und, obwohl von FeS-Clustern abhängig, durch Eisen- Defizienz sogar stimuliert wird. Obwohl die molekularen Mechanismen der Molybdän/Eisen-Interaktion und die Funktion der Mitochondrien hierbei noch unklar sind konnte somit belegt werden, dass die Moco-Synthese, offenbar aufgrund der essenziellen Bedeutung der Molybdoenzyme, einen priorisierten Stoffwechselweg darstellt, dem die Pflanze selbst unter starken Mangelbedingungen die entsprechend benötigten Mengen an Molybdän und Eisen zukommen lassen muß.
Publications
-
(2011) Identification of an Arabidopsis solute carrier critical for intracellular transport and interorgan allocation of molybdate. Plant Biology 13; 710-718
Gasber, A., Klaumann, S., Trentmann, O., Trampczynska, A., Clemens, S., Schneider, S., Sauer, N., Feifer, I., Bittner, F., Mendel, R.R., and Neuhaus, E.
-
(2013) Molybdenum cofactor biosynthesis and crosstalk with ironsulfur. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry, edited by R.A. Scott. John Wiley & Sons, Ltd: Chichester, UK
Bittner, F. & Mendel, R.R.
-
(2014) Molybdenum metabolism in plants and crosstalk to iron. Frontiers in Plant Science 5; 28
Bittner, F.
