Pathologie hyperaktive Mutanten des Transkriptionsfaktors STAT1
Final Report Abstract
STAT1 ist der von allen Mitgliedern der STAT-Famllle mutmaßlich am besten untersuchte Transkriptionsfaktor, dennoch bleiben viele Fragen bezüglich des Mechanismus seiner effektiven Zielgenerkennung unbeantwortet. Dieses betrifft insbesondere die molekularen Schritte bei der Bindung an spezifische DNA-Bindestellen, der Rekrutierung von Koaktivatoren der Transkriptionsmaschinerie und der Regulation der Genexpression, die im Zusammenhang mit ihren jeweiligen molekularen Mechanismen bislang nur fragmentarisch verstanden sind. In diesem Projekt wurden Mutanten des Transkriptionsfaktors STAT1 generiert und im Weiteren hinsichtlich ihrer DNA-Bindeaffinität und Transaktivierungsleistung charakterisiert, dieses mit der ausdrücklichen Maßgabe bislang unbekannte biochemische Mechanismen der Zielgenaktivierung zu erfassen. Erstmalig wurden in diesem Projekt STAT1-Mutanten generiert, die eine höhere Affinität zu ihren spezifischen palindromischen DNA-Bindestellen (GAS-Stellen) bzw. eine verbesserte kooperative DNA-Bindung aufweisen. Diese DNA-Bindemutanten wurden als nützliche Werkzeuge zum Studium der Zielgenaktivierung eingesetzt. So konnte durch Mutation zweier Glutaminsäurereste in der DNA-Bindedomäne ein Reaktionsmechanismus aufgedeckt werden, der die Dissoziation von phosphorylierten STAT1-Dimere von DNA bewerkstelligt. Zwei negativ geladene Aminosäurereste in der DNA-Bindedomäne kontaktieren das Phosphodiester-Rückgrat der DNA und fungieren als molekularer Schalter, der sequenzunabhängig DNA-gebundene Dimere freisetzt. Mit der Einführung zweier Aminosäuresubstitutionen resultiert ein mutierter Transkriptionsfaktor mit verbesserter Affinität zu den spezifischen, palindromischen STAT1-Bindestellen. Durch Substitutionsmutationen lässt sich die Dissoziation von DNA inhibieren und eine verstärkte Bindung an hoch-affinen GAS-Stellen erreichen. Trotz der erhöhter Affinität zu GAS-Stellen und einer insgesamt gesteigerten Konzentration an phosphorylierten STAT1-Dimeren im Zellkern ist die transkriptionelle Aktivität nach IFNy-Stimulation dennoch signifikant reduziert. Diese verminderte Genaktivierung erklärt sich zum einen durch unspezifische DNA-Bindung außerhalb von kanonischen GAS-Stellen, möglicherweise aber auch durch eine verminderte Austauschreaktion an den Promotoren der Zielgene. Eine hohe Dissoziationsrate von DNA ist deshalb ein Schlüsselfaktor der STAT1-vermittelten Signaltransduktion, der erklärt, warum hyperphosphorylierte STAT1-Mutanten mit erhaltener GAS-Diskriminierung und erhöhter DNA-Bindeaktivität schlechtere transkriptionelle Aktivität erbringen als das Wildtyp-Protein. Zudem wurden im Rahmen dieser Arbeit Mutationen im STAT1-Molekül entdeckt, die entweder in einer verbesserten kooperativen DNA-Bindung bzw. einer verbesserten transkriptionellen Aktivität resultierten. Diese zweite Kategorie von DNA-Bindemutanten mit erhaltener GAS-Diskriminierung zeigt eine differentielle Genaktivierung, die von der Art des zur Stimulation benutzten Interferontyps abhängt. Hinweise auf das Vorliegen von STAT1-Mutationen der beschriebenen Art bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie (n=235) oder verschiedenen Leukämieentitäten (n=25) konnten in kleineren Patientenstichproben allerdings nicht gefunden werden.
Publications
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