Alternatives Spleißen der CD19 mRNA in pädiatrischer Leukämie und CART-19-Therapieresistenz - Regulatoren, genetische Varianten und kryptische Isoformen

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Julian König, Ph.D.; Professor Dr. Stefan Legewie; Professorin Dr. Katharina Zarnack
• Fachliche Zuordnung: Bioinformatik und Theoretische Biologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2016
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 327638004

Alternatives Spleißen spielt eine zentrale Rolle für die Proteindiversität in eukaryotischen Zellen, z.B. während der Embryonalentwicklung, kann aber auch an der Krankheitsentstehung beteiligt sein. Spleißen wird durch das Spleißosom katalysiert und durch RNA-bindende Hilfsproteine (RBPs) moduliert. Es ist bisher nicht vollständig verstanden, wie RBP- und Spleißosomkomplexe dynamisch auf prä-mRNA-Sequenzen interagieren (Spleiß-Code).In diesem Projekt nutzen wir einen systembiologischen Ansatz, um den Spleiß-Code besser zu verstehen. Als prototypisches Beispiel untersuchen wir das MSTR1-Gen, das in Krebszellen ein verändertes Spleißmuster aufweist, und dadurch die Tumorinvasivität begünstigt. Die entwickelten Methoden sollen zudem auf andere interessante Spleißszenarien übertragen werden.Um das Spleißen besser zu verstehen, haben wir einen großskaligen Mutagenese-Ansatz etabliert, in dem wir mehr als 5,500 MSTR1-Minigenvarianten mit durchschnittlich je drei Mutationen studieren. Diese Minigen-Bibliothek wird in HEK293T-Zellen transfiziert und das Spleißverhalten durch RNA-Sequenzierung charakterisiert. Wir planen durch bioinformatische Analysen die Häufigkeit der fünf Haupt-Spleißprodukten für jeden Mutante zu extrahieren und zudem neue, durch kryptische Spleißmotive entstehende Spleißprodukte zu identifizieren. Diese komplexen Spleißmuster werden durch mathematische Modelle interpretiert, um geänderte Kinetiken einzelner Spleißreaktionen sowie die kausalen Punktmutationen abzuleiten. Hauptergebnis dieses ersten Arbeitspakets wird eine Sammlung cis-regulatorischer Sequenzen des MSTR1-Gens sein.In Arbeitspaket 2 werden wir durch einen großskaligen siRNA-basierten Störungssansatz in allen 5,500 Minigenvarianten charakterisieren, wie RBPs und Spleißosom-Komponenten die prä-mRNA-Sequenz lesen, um kontextspezifisches Spleißen zu etablieren. Datenbasierte mathematische Modelle werden Hypothesen generieren, welche Spleißraten die perturbierten Proteine regulieren, an welche Sequenzen sie binden und welche Protein-Protein-Komplexe sie ausbilden. Das Netzwerk-Modell soll bioinformatisch mit publizierten Daten abgeglichen und in Teilen experimentell validiert werden.In Arbeitspaket 3 werden wir bioinformatische und genomweite experimentelle Ansätze (RNAseq, iCLIP) kombinieren, um zu untersuchen, ob für MSTR1 geltende Regeln auch allgemein für das zelluläre Spleißen zutreffen. Desweiteren werden wir ein dynamisches mathematisches Modell des MSTR1-Spleißens ableiten, um den Einfluss der zellulären RBP-Expressionsmuster auf das alternative Spleißen zu beschreiben.Zusammenfassend schlagen wir einen systematischen Ansatz vor, mit dem das Spleißverhalten zunächst für prototypische Beispiele charakterisiert wird und die Erkenntnisse dann auf die genomweite Ebene übertragen werden. Durch diese Forschung erhoffen wir uns Einblicke in die Modulation krankheitsrelevanter Spleißreaktionen durch Einzelnukleotid-Polymorphismen sowie durch RBP-Expressionsmuster.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen