Regulation of the Inhibitor of Growth ING5 by Cyclin-dependent kinases and functional interaction with the tumor suppressor p53
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das MYC-Onkoprotein spielt eine zentrale Rolle bei der Kontrolle der Zellproliferation. Eine wichtige Funktion ist dabei die Regulation des Übergangs von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus. In diesem Zusammenhang ist ein wesentlicher Schritt die indirekte Aktivierung des Cyclin E/CDK2-Kinasekomplexes, die zur vollständigen Inaktivierung des Restriktionspunktes führt und verschiedene S-Phase-spezifische Prozesse stimuliert. Allerdings war zu Beginn der Arbeiten wenig über die direkten Substrate der Cyclin E/CDK2 bekannt. Deshalb haben wir einen Screen entwickelt, in dem wir mit rekombinantem Cyclin E/CDK2 bakteriell exprimierte Proteine auf einem Array phosphoryliert haben. Bei diesen Untersuchungen identifizierten wir ING5, ein Protein aus der Familie der Inhibitor of Growth Proteine. Für ING1, dem am besten untersuchten Mitglied der Familie war bekannt, dass es die Funktion des Tumorsuppressors p53 reguliert. Es lag deshalb nahe, zu überprüfen, ob ING5 ebenfalls mit p53 interagiert und möglicherweise phosphorylierungsabhängig die Funktion von p53 reguliert. Nach anfänglich positiven Befunden mussten wir dann aber feststellen, dass ING5 zwar die Proliferation und die Apoptose von Zellen reguliert, dies aber unabhängig von p53 zu erfolgen scheint. In einer ersten Phase des Projektes haben wir die Befunde aus dem Screen und die Identifizierung der Phosphorylierungsstelle in ING5 verifiziert. Dazu haben wir monoklonale Antikörper gegen die Threonin 152 Phosphorylierungsstelle in ING5 hergestellt und nachweisen können, dass diese Phosphorylierung zellzyklusabhängig auf exogenem und endogenem ING5 erfolgt. Zudem weisen eine Reihe von Versuchen eindeutig darauf hin, dass die Regulation der Cyclin E/CDK2 die Phosphorylierung an Threonin 152 beeinflusst. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass wir mit ING5 ein neues Cyclin E/CDK2- Substrat identifiziert haben. Eine Neuinterpretation der erarbeiteten Befunde zusammen mit weiteren Resultaten führten dann zur Formulierung einer neuen Hypothese, in der wir postulieren, dass ING5 möglicherweise die Funktionen von MYC reguliert. Diese Hypothese war auch deshalb interessant für uns, da die zu Grunde liegende Anfangshypothese unserer Arbeiten eine Regulation der Cyclin E/CDK2 durch MYC beinhaltete. Mit den Befunden, dass sowohl ING5 wie auch MYC Substrate der Cyclin E/CDK2 sind, postulieren wir, dass ING5 als Regulator für MYC wirkt und unter anderem Cyclin E/CDK2-Signale integrieren kann. Diese Hypothese wird durch unsere Befunde gestützt, die eine direkte Wechselwirkung von ING5 mit MYC aufzeigen. Die Interaktion der beiden Proteine selber scheint allerdings phosphorylierungsunabhängig zu sein. Zudem kann ING5-T152A, eine Mutante, die nicht durch Cyclin E/CDK2 phosphoryliert werden kann, die Funktionen von MYC regulieren und unter anderem die MYC/Ha-RAS-abhängige Transformation von primären Rattenembryofibroblasten inhibieren. Die weiteren Untersuchen zu ING5 haben zudem ergeben, dass ein Knockdown von ING5 zu einer starken Inhibition des Zellwachstums führt. Dabei scheint der primäre Effekt des Fehlens von ING5 eine Stimulation der Apoptose zu sein. Es ist möglich, dass dieser Effekt direkt mit der Funktion von ING5 als Regulator von MYC zusammenhängt. Da MYC als potenter proapoptotischer Faktor beschrieben ist, könnte die Herunterregulation des MYC-Inhibitors ING5 Apotose in Zellen induzieren. Erste Hinweise deuten darauf hin, dass dieses der Fall sein könnte. Insgesamt haben wir mit den hier zusammengefassten Arbeiten mit ING5 einen neuen Interaktionspartner von MYC identifiziert, der möglicherweise durch die Aktivität von MYC und die Stimulation der Cyclin E/CDK2 in einem engen regulatorischen Verhältnis mit MYC steht, das es nun weiter aufzuklären gilt.
