Ribosomal peptide secondary metabolites from fungi
Final Report Abstract
Das vorliegende Projekt hatte zum Ziel, die Biosynthese des pilzlichen RiPPs Omphalotin A, sowie gegebenenfalls weiterer Derivate, aufzuklären. Die biochemischen Arbeiten sollten sich aus der Aufklärung der Röntgenkristallstruktur des für die Biosynthese zuständigen Minimalclusters, bestehend aus der Methyltransferase OphMA und der Prolyloligopeptidase OphP, zusammensetzen. Die enzymatische Charakterisierung weiterer im Gencluster annotierter Enzyme, den zwei P450 Monooxygenasen OphM1 und OphM2 und der Acetyltransferase OphC, sowie deren Beteiligung an der Biosynthese der Omphalotin-Derivate standen zudem im Fokus. Die organische Synthese von potentiellen Peptidsubstraten sowie von Omphalotin A und seinen Derivaten sollte Unterstützung für die Durchführung von in vivo und in vitro Assays liefern. Projektziel A, die Umsetzung zellfreier Extrakte von O. olearius mit synthetischen Peptidsubstraten, wurde nicht durchgeführt, da der Biosynthesemechanismus der Methyltransferase das Versuchsdesign in dieser Form nicht sinnvoll erscheinen ließ. Projektziel B beinhaltete die Klonierung, Expression und enzymatische Charakterisierung der Gene ophM, ophMA und ophP in einem heterologen Expressionswirt. Das Projektziel ist nahezu erfüllt und die Ergebnisse teilweise veröffentlicht. Alle Gene konnten aus dem Genom von O. olearius kloniert und in E. coli bzw. P. pastoris exprimiert werden. Das führte zur vollständigen Charakterisierung der Methyltransferase OphMA durch Dr. Sascha Ramm. Die Prolyloligopeptidase OphP wird derzeit noch durch die Doktorandin Sarah Brokmeier untersucht. In Projektziel C wurde festgelegt, die Monooxygenasen OphM1 und OphM2 sowie die Acetyltransferase OphC zu klonieren und enzymatisch zu charakterisieren. Alle drei Enzyme wurden aus O. olearius kloniert und können in E. coli exprimiert werden. Zudem wurde nach Fertigstellung des Antrags eine dritte Monooxygenase annotiert und kloniert. Die enzymatische Charakterisierung aller genannten Enzyme ist derzeit in Bearbeitung. Die Experimente zur Geninaktivierung, welche in Projektziel D festgelegt wurden, wurden durchgeführt. Es gelang ihr mittels A. tumefaciens einen O. olearius-Stamm zu erzeugen, der eine Resistenzkassette gegen Hygromycin B im Genom integriert hatte. Die in Projektziel E anvisierte in vivo Rekonstitution der Biosynthese und heterologe Omphalotin-Produktion konnte in Teilen erfolgreich ausgeführt werden. Es gelang Dr. Sascha Ramm Omphalotin A heterolog in P. pastoris durch Coexpression von OphMA und OphP zu produzieren. Auch in E. coli deuten die Ergebnisse von Sarah Brokmeier auf eine Produktion von Omphalotin A hin. Die Versuche zur heterologen Produktion anderer Omphalotin-Derivate durch Coexpression von OphMA, OphP und jeweils einer der P450 Monooxygenasen blieben bisher ergebnislos. Projektziel F beinhaltete die Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse von OphMA und OphP. Das Ziel wurde für die Methyltransferase OphMA erreicht: Die Kristallstruktur des Proteins konnte vollständig mithilfe der AG Wahl aufgeklärt werden. Im Falle von OphP wird zurzeit die Proteinreinigung optimiert, um eine Kristallisation und anschließende Strukturaufklärung möglich zu machen. Projektziel G setzt sich aus mehreren Unterpunkten zusammen. Punkt 1, die Synthese von linearen Omphalotin-Vorläufern, ist weitestgehend durch Dr. Marcel Tietzmann abgeschlossen worden. Punkt 2, der Ala-Scan linearer Omphalotin-Precursor-Peptide ist teilweise erbracht worden, wird jedoch nicht weiter verfolgt, da Naismith et al. ihrerseits Ergebnisse dazu veröffentlicht haben. Der letzte Unterpunkt beinhaltete die Totalsynthesen von Omphalotinen. Omphalotin A konnte hierbei erfolgreich durch die Doktorandin Caroline Knittel in einer neu etablierten automatisierten Festphasensynthese hergestellt werden. Die Synthese weiterer Omphalotin-Derivate und die Charakterisierung des Wirkmechanismus ist derzeit in Bearbeitung. Wir werden die Synthese von Omphalotinen, die Arbeiten zum Biosynthesemechanismus und zur Wirkmechanismus weiterverfolgen.
Publications
- “A Self-Sacrificing N-Methyltransferase Is the Precursor of the Fungal Natural Product Omphalotin Biological”. Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 9994 – 9997
Sascha Ramm, Bartlomiej Krawczyk, Agnes Mühlenweg, Annette Poch, Eva Mösker, and Roderich D. Süssmuth
(See online at https://doi.org/10.1002/anie.201703488)
