Analysis of coupling between substrate binding and ATP hydrolysis in canonical homo- and heterodimeric amino acid ABC import systems
Metabolism, Biochemistry and Genetics of Microorganisms
Final Report Abstract
ABC (ATP-binding cassette)-Transporter stellen eine der größten Proteinfamilien dar, kommen in allen Organismen vor, und koppeln die Translokation chemischer Verbindungen über biologische Membranen an die freie Energie der ATP Hydrolyse. Sie sind modular aufgebaut aus zwei Transmembrandomänen, die transient eine Translokationspore bilden sowie zwei nukleotidbindenden Domänen, die ATP binden und hydrolysieren. Kanonische ABC-Importsysteme, die über ein extrazelluläres Substratbindeprotein als zusätzliche Komponente verfügen, vermitteln die Aufnahme einer Vielzahl chemischer Verbindungen in das Cytoplasma prokaryotischer Zellen. Auch weil einige dieser Systeme als Virulenzfaktoren pathogener Bakterien identifiziert wurden, ist das genaue Verständnis ihres Wirkmechanismus von allgemeiner Bedeutung. Am Beispiel von zwei Aminosäuretransportern haben wir die Dynamik der Wechselwirkung des Transportkomplexes mit dem Bindeprotein während des Transportzyklus untersucht und sind der Frage nachgegangen, ob ein oder zwei Substratbindestellen in den Transmembrandomänen vorliegen. So konnten mit Hilfe von Elektronenspinresonanzspektroskopie (DEER) beim Histidintransporter aus Salmonella enterica (HisQMP2) unterschiedliche, substratabhängige Interaktionen mit dem Bindeprotein HisJ im nukleotidgebundenen Zustand aufgezeigt werden. Darüber hinaus sind experimentell ermittelte Abstände für zwei Interaktionspaare [HisQM(A96R1)P2_HisJ(G24R1) und HisQ(D91R1)MP2_HisJ(G24R1)] mit der Orientierung des HisJ in einem Dockingmodell vereinbar. Mutationsanalysen der transmembranen Untereinheiten HisQM auf Basis eines Homologiemodells ergaben Hinweise auf nur eine Substratbindestelle in HisM, die jedoch durch ein hochkonserviertes Aspartat in HisQ essentiell komplettiert werden muss. Unterstützt wird diese Hypothese durch den erstmals gelungenen Nachweis eines deuterierten Histidinmoleküls in HisM über Spinmarkierung in Verbindung mit 2H-ESEEM. Im homodimeren Arginin/Lysin/Histidin-Transporter aus Geobacillus stearothermophilus (ArtM2P2) wurden die an der Substratbindung vermuteten Reste in ArtM ebenfalls durch Mutationsanalyse charakterisiert und dabei die Bedeutung zweier negativ geladener Reste für die Funktion bestätigt. Darüber hinaus wurde gefunden, dass die Mutation ArtM-L67D zum fast vollständigen Aktivitätsverlust, ermittelt über ATPase- und Transportaktivität der gereinigten Variante, führt. Auf Basis dieser Erkenntnis wurde ein Hybridtransporter konstruiert, der eine intakte (ArtM-Wildtyp) und eine gestörte Substratbindestelle (ArtM-L67D) aufweist. Der gereinigte Hybridtransporter zeigte ähnliche Aktivitäten wie der native Transporter, was darauf schließen lässt, dass nur eine der beiden Bindestellen zur Auslösung des Transportzyklus mit Substrat belegt sein muss. Ob unter physiologischen Bedingungen trotzdem zwei Substratmoleküle transient gleichzeitig an ArtM2 binden, bleibt derzeit offen.
