Molekulare Mechanismen von Nitratreduktion, NO-Synthese und post-translationaler Regulation pflanzlicher Nitratreduktasen

• Antragstellerin: Dr. Katrin Schrader
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 315507948

Die pflanzliche Nitratreduktase (NR) ist ein essenzielles homodimeres Enzym mit drei prosthetischen Gruppen (Molybdäncofaktor, Häm, FAD). Neben seiner primären metabolischen Funktion in der Reduktion von Nitrat zu Nitrit, was als erster und geschwindigkeitsbestimmender Schritt in der Stickstoff-Assimilation von Pflanzen gilt, ist die NR ebenfalls in der Lage Nitrit zum Signalmolekül Stickstoffmonoxid (NO) zu reduzieren. Obwohl viele downstream-Prozesse und Aufgaben des produzierten NO bereits bekannt sind, ist der Reaktionsmechanismus, wie NR Nitrit zu NO reduziert, noch weitgehend unklar. Während der Nitratreduktion kommt es zu Domänenbewegungen, um einen effizienten internen Elektronentransfer zu gewährleisten. Auf Proteinebene regulieren 14-3-3-Proteine die Aktivität von phosphorylierter NR, indem sie über eine seit langem bekannte hochaffine und eine neu entdeckte niedrigaffine Stelle an das Enzym binden und so den internen Elektronentransfer unterbinden. Es ist noch unbekannt, in wie weit die NO Synthese-Aktivität der NR auch einer solchen post-translationalen Regulation unterliegt.Unser Ziel ist es, den molekularen Mechanismus der Nitritreduktion durch pflanzliche NR sowie das Zusammenspiel der Nitrat- und der Nitritreduktion zu verstehen. Als Modellproteine sollen die beiden NR-Isoformen aus Arabidopsis thaliana, AtNIA1 und AtNIA2, untersucht und charakterisiert werden, da allgemein angenommen wird, dass AtNIA1 hauptsächlich als Nitritreduktase agiert, wohingegen AtNIA2 insbesondere die Nitratreduktion katalysiert. Beide Enzyme sollen sowohl in voller Länge als auch als Domänenfragmente als Wildtyp und mit gezielten Mutationen exprimiert und gereinigt werden. Anschließend sollen die kinetischen Eigenschaften der reinen Enzyme für jede Reaktion bestimmt werden, und für die jeweilige Reaktion funktionell wesentliche Reste identifiziert werden. Außerdem werden wir den Einfluss von 14-3-3-Proteinen im Hinblick auf die Aktivitäten beider Isoformen untersuchen sowie die Bindungseigenschaften bestimmen, um die Unterschiede zwischen den NR-Isoformen aufzudecken. Da sich während der Katalyse die Domänen der NR bewegen, ist die Aufklärung der Struktur-Funktionsbeziehung der NR von großem Interesse. Deshalb werden wir pflanzliche NR im aktiven und im 14-3-3-inhibierten Zustand kristallisieren. Die Stabilisation des Inhibitionskomplexes wird durch spezifische kovalente Vernetzung zwischen beiden Proteinen durchgeführt. Dies setzt voraus, dass wir die vor kurzem beschriebene niedrigaffine Bindungsstelle im 14-3-3 identifizieren und charakterisieren, da sie bisher noch unbekannt ist.Im Rahmen dieses Projekts soll die mechanistische Grundlage der Nitritreduktion durch NR, die individuellen spezifischen Funktionen von verschiedenen NR-Isoformen sowie die strukturellen Eigenschaften der NR im aktiven und im 14-3-3-inhibierten Zustand aufgeklärt werden, um die komplexe Enzymfunktion sowie das Zusammenspiel der Isoformen in Arabidopsis zu verstehen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen