Struktur-Eigenschaftsbeziehung von Proteinkristallen hinsichtlich Aufarbeitung und Formulierung

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Dr. Rebekka Biedendieck; Professorin Dr. Anett Schallmey; Professor Dr.-Ing. Carsten Schilde
• Fachliche Zuordnung: Bioverfahrenstechnik ; Mechanische Verfahrenstechnik
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 315462951

Enzyme in Proteinkristallen eignen sich besonders aufgrund ihrer sehr hohen volumenspezifischen katalytischen Aktivität und der hohen Resistenz gegen chemische und enzymatische Zerstörung für den Einsatz als immobilisierte Biokatalysatoren. Da in diesen Immobilisaten die Enzymaktivität und Produktfreisetzungsrate sowie deren mechanische Stabilität während der Prozessierung eng mit der Kristallform und Partikelgröße zusammenhängen, soll deren molekulare Basis systematisch untersucht werden. Dazu wurde in der ersten Förderphase die gesamte Prozesskette der genetischen Modifikation, Produktion, Reinigung, Kristallisation, Quervernetzung und mechanischen Charakterisierung für die Modellproteine Halohydrindehalogenase (HheG) und Penicillin G Acylase (PGA) aufgebaut. Für die PGA wurden erstmals die Strukturen von drei Enzymen unterschiedlicher Thermostabilität gelöst. Für beide Modellproteine wurden erfolgreich zahlreiche Proteinvarianten genetisch erzeugt und produziert, sowie hinsichtlich ihrer Aktivität und thermischer Stabilität getestet. Für die jeweils aussichtsreichsten Varianten wurden sowohl native als auch quervernetzte Kristalle hergestellt und hinsichtlich ihrer mechanischen und katalytischen Eigenschaften untersucht. Aktuell wird die Modellierung der Proteinpartikelstruktur mittels der Diskreten Elemente Methode durchgeführt, um das Verhalten der Kristalle abzubilden. In der zweiten Förderphase liegt der Fokus auf der gezielten Modifikation der Proteine für eine effiziente Quervernetzung im Kristall über gentechnische und chemische Methoden. Dabei dient die HheG für vertiefende Detailstudien zum Einfluss der Quervernetzung auf die mechanische Stabilität, während die verschiedenen PGAs zum Testen der Transferierbarkeit gewonnener Erkenntnisse genutzt werden sollen. Neben der gezielten genetischen Modifikation der Enzyme soll besonders die Maßstabsvergrößerung von Produktion, Reinigung, Kristallisation und Quervernetzung etabliert werden, um das mechanische Verhalten der quervernetzten Kristalle in Modellprozessen abzubilden. Zugleich sollen durch statistische und numerische Methoden die Änderungen des mechanischen Verhaltens der Kristalle auf Grundlage der Proteinwechselwirkungen sowie der Quervernetzungsstellen erklärt werden. Zusammengefasst sollen die strukturellen Prinzipien der Kristallbildung und Quervernetzung aufgeklärt werden, um dann gezielt thermisch und mechanisch stabile, dabei katalytisch aktive Proteinkristalle für die biotechnologische Anwendung gewinnen zu können.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1934: Dispersitäts-, Struktur- und Phasenänderungen von Proteinen und biologischen Agglomeraten in biotechnologischen Prozessen
• Mitverantwortlich: Dr.-Ing. Ingo Kampen