Entwicklung und Anwendung von RoCK, einem neuen Rhodopsinzyklase/K+ - Kanal-basierten optogenetischen Werkzeug zur Inhibierung erregbarer Zellen

Die Optogenetik erlaubt es, biologische Prozesse mithilfe von Licht mit bisher nie dagewesener räumlich-zeitlicher Kontrolle zu steuern, um das Verhalten von Zellen, Netzwerken oder lebenden Tieren zu beeinflussen. Im Gegensatz zur Erfolgsgeschichte ‚erregender‘ Rhodopsinvarianten ist die Effektivität Erregungs-hemmender optogenetischer Werkzeuge verbesserungsbedürftig. Hierzu haben wir in der ersten Projektphase des SPP1926 einen Licht-aktivierbaren K+-Kanal (PACK) entwickelt. PACK verbindet eine lichtgesteuerte Adenylylzyklase (PAC) mit einem cAMP-gesteuerten K+-Kanal (SthK). PACK inhibiert Aktionspotenziale in Neuronen von Maus und Zebrafisch in vitro und in vivo, und hemmt die Aktivität von Kaninchen-Kardiomyozyten. Die Vorteile von PACK gegenüber anderen hemmenden Werkzeugen sind: i) Unterdrückung der elektrischen Erregbarkeit, basierend auf Aktivierung einer K+-Leitfähigkeit, ähnlich nativer Zellinhibierung, wodurch Ruhemembranpotenzial und native Ionengradienten erhalten bleiben, ii) hervorragende Photonenbilanz, da kurze (10 ms) Lichtpulse moderater Intensität ausreichen, um Aktionspotenziale für >60 s zu unterbinden. Allerdings schränkt die langsame ,Off-Kinetik‘ (aufgrund langlebiger PAC-Photozyklusintermediate) die Anwendbarkeit von PACK zur Untersuchung zellulärer Erregbarkeit im (Sub)-Sekunden-Bereich ein. Außerdem könnte der interne Botenstoff von PACK, cAMP, auch andere zelluläre Signalwege beeinflussen. In der zweiten Projektphase des SPP1926 möchten wir diese Nachteile überwinden und ein neuartiges optogenetisches System entwickeln, das cGMP als Botenstoff verwendet. Dafür werden wir eine Rhodopsinguanylylzyklase mit einem cGMP gesteuerten K+-Kanal kombinieren (RoCK). In Vorversuchen haben wir die kürzlich charakterisierte Rhodopsinguanylylzyklase aus Caterina anguillulae und einen konstruierten cGMP–abhängigen Sthk-Prototypkanal in Neuroblastoma-/DRG-Zellen sowie in einer Kardiomyozytenzelllinie exprimiert. Kurze Lichtpulse initiieren Ströme vergleichbarer Amplituden wie mit PACK, aber mit einer mehr als 10x schnelleren Off-Kinetik. Wir planen, RoCK weiterzuentwickeln, indem wir optimierte Enzym- und Kanalversionen selektieren oder konstruieren. Wir werden rot-verschobene und präsynaptisch lokalisierte RoCK-Varianten herstellen. Zunächst werden wir diese in Zelllinien, primären Neuronen, und Kardiomyozyten in vitro testen. Außerdem planen wir, RoCK zur transienten, optischen Ablation von Vorhofflimmern in intaktem Herzgewebe in situ zu nutzen. Schließlich werden wir mit RoCK das Verhalten von Spinalneuronen und retinalen Ganglienzellen von Zebrafischen in vivo untersuchen. Wir erwarten, dass RoCK ein vielseitig einsetzbares optogenetisches Werkzeug mit Potential zur Verwendung in Neurowissenschaften, Herzforschung, und darüber hinaus darstellt.

DFG-Verfahren Schwerpunktprogramme

Teilprojekt zu SPP 1926:  Next Generation Optogenetics: Tool Development and Application

Ehemalige Antragstellerin Dr. Yinth Andrea Bernal Sierra, bis 12/2022