Regulation der miRNA-Biogenese in Arabidopsis - RNA-Affinitätsaufreinigung zur Charakterisierung von pri-miRNA Bindeproteinen

• Antragsteller: Dr. Tino Köster
• Fachliche Zuordnung: Pflanzenphysiologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 314773174

Posttranskriptionelle Regulationsprozesse werden durch Proteine und kleine RNAs koordiniert und spielen eine wichtige Rolle bei der Steuerung der eukaryotischen Genexpression. Zu den kleinen regulatorischen RNAs gehören die ~21 nt großen, einzelsträngigen microRNAs (miRNAs), die an komplementäre Sequenzen von mRNAs binden und deren Expression inhibieren. Hierdurch steuern miRNAs wichtige physiologische Prozesse wie die Entwicklung von Organismen und deren Reaktion auf Umweltsignale. MiRNAs werden aus längeren Vorläufern, den pri-miRNAs, prozessiert. Dabei entstehen zunächst die prä-miRNA stem-loops, aus denen die reifen miRNAs freigesetzt werden. Die Biogenese von miRNAs wird durch RNA-Bindeproteine (RBPs) und Strukturcharakteristika der RNA beeinflusst. RBPs beeinflussen somit den Pool regulatorischer miRNAs und damit die Expression der miRNA Targetgene. Die Prozessierung von pri-miRNAs in Pflanzen unterscheidet sich in wesentlichen Punkten von der Prozessierung in Tieren und das Wissen um regulatorische RBPs in Pflanzen ist limitiert. Ziel des Projekts ist die Identifizierung von RBPs, die direkt an pri-miRNAs binden und deren Prozessierung regulieren. Dies erfolgt mittels RNA-Affinitätsaufreinigung. Dazu werden in vitro Transkripte ausgewählter pri-miRNA stem-loops mit der 16 nt langen Erkennungssequenz der CRISPR Endoribonuklease Csy4 gekoppelt. Eine enzymatisch inaktive Variante des Csy4-Proteins (Csy4*) wird in E.coli heterolog exprimiert und aufgereinigt. Nach Biotinylierung wird das Csy4* Protein an einer Streptavidinmatrix immobilisiert. Danach werden die markierten pri-miRNA stem-loops über die Bindung an das Csy4* Protein auf die Matrix geladen.Um die Bindung spezifischer RBPs aus Arabidopsis an die stem-loop Strukturen der pri-miRNAs zu ermöglichen, werden die immobilisierten Csy4*-RNA Komplexe mit Kernextrakten inkubiert. Durch die Zugabe von Imidazol wird die Endoribonukleaseaktivität von Csy4* reaktiviert, wodurch die Erkennungssequenz abgespalten wird und die pri-miRNA stem-loops mit daran gebundenen Proteinen freisetzt werden.Die Methode wird anhand bekannter trans-aktiver Regulatoren der miRNA-Biogenese und genereller Prozessierungsfaktoren der pri-miR398b optimiert. Die umfassende Identifizierung kopräzipitierter RBPs erfolgt anschließend mittels Massenspektrometrie anhand der spezifischen Anreicherung gegenüber Kontrollpräzipitaten.Die physiologische Funktion ausgewählter RBPs für die miRNA-Biogenese wird anschließend mit Hilfe von Mutanten untersucht. Um einen genomweiten Einblick in den Umfang und den Mechanismus der Regulation zu erhalten, werden alle direkt durch die RBPs gebundenen pri-miRNAs sowie ihre exakten Bindungsstellen identifiziert.Insgesamt ermöglicht das Projekt einen tieferen Einblick in die molekularen Regulationsmechanismen der Prozessierung von miRNAs durch pflanzliche RBPs. Es trägt dazu bei, neue regulatorische Prinzipien der Steuerung von Genexpression zu entschlüsseln.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen