LNA-vermittelte Interferenz der HIV-1 Genexpression: ein neuer Ansatz für eine antiretrovirale Therapie

• Antragsteller: Professor Dr. Heiner Schaal
• Fachliche Zuordnung: Virologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 314480083

Während der HIV-1 Replikation wird das RNA(+) Genom revers-transkribiert, in doppelsträngige DNA umgeschrieben und in das Wirts-Zell-Genom inseriert. Nach der Transkription des Provirus wird eine polycistronische prä-mRNA generiert, die den Zellkern entweder intronlos, noch ein oder mehrerer Introns enthaltend oder ungespleißt verlässt. Selbst geringe Störungen des ausbalancierten Gleichgewichts zwischen den gespleißten und der ungespleißten viralen mRNA können sich drastisch auf die HIV-1 Infektiosität und Pathogenese auswirken. Wir konnten kürzlich zeigen, dass zwei konservierte spleißregulatorische Elemente, das GI3-2 und das ESEtat Element, eine essentielle Rolle für die Generierung der viralen vpr, vif und tat mRNAs spielen. Zudem führten Mutationen dieser Elemente zu einer Inhibition der Virusreplikation. Im Hinblick auf die Entwicklung einer möglichen antiretroviralen Therapie, welche die HIV-1 Genexpression zum Ziel hat, haben wir in diesem Zusammenhang beide Elemente mittels antisense-Oligonukleotiden maskiert, was ebenfalls in einer Blockierung der HIV-1 Partikelproduktion resultierte. Als Oligonukleotide haben wir sogenannte Locked Nucleic Acids (LNAs) verwendet. Diese modifizierten Nukleotide besitzen aufgrund einer zusätzlichen Methylenbrücke eine ideale Konformation für Watson-Crick Bindungen. Neben einer Vielzahl von Vorteilen gegenüber anderen antisense-Oligonukleotide können Zellen LNAs auch ohne Transfektionsreagenzien aufnehmen (Gymnosis), was diese Oligonukleotide für therapeutische Anwendungen attraktiv macht. Fokus dieses Antrags ist die HIV-1 Genexpression als potenziellen Angriffspunkt für eine neue antiretrovirale Therapie zu nutzen, wobei sich LNAs für die Entwicklung einer solchen Therapie vielversprechend anbieten. Hierbei sollen die LNAs gymnotisch, also ohne Zusatz von Transfektionsreagenzien, appliziert werden. Unsere vorläufigen Ergebnisse zeigen, dass gymnotisch aufgenommene LNAs die virale Replikation noch effizienter stören als transfizierte LNAs, überraschenderweise aber nicht im Zellkern, sondern im Cytoplasma lokalisieren und hier offensichtlich die Degradation der viralen mRNAs mit ihrer Zielsequenz einleiten. Ob die LNAs zu einem späteren Zeitpunkt auch im Kern akkumulieren und dort, wie im Fall nach ihrer Transfektion, dann ihre Targetsequenzen maskieren und dadurch die Bindung der spleißregulierenden Proteine verhindern, soll ebenfalls untersucht werden. Neben der Lokalisation sollen die zugrundeliegenden RNA Degradations-Mechanismen (on-target Effekte) entschlüsselt und mögliche zusätzliche LNA-vermittelte off-target Effekte, einschließlich einer möglichen Stimulation der angeborenen Immunantwort aufgedeckt werden. Schließlich streben wir die Identifikation weiterer effizienter LNA Ziele im HIV-1 Genom an, um antivirale LNAs mit unterschiedlichen Sequenzen in einem LNA-Cocktail zu vereinen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen