Nanobody-assisted structural and functional studies of the human ADP-ribosyltransferase ARTD4
Structural Biology
Cell Biology
Final Report Abstract
ADP-Ribosyltranferasen regulieren wichtige zelluläre Prozesse. ARTD1 ist das wohl bekannteste Mitglied der ARTD-Familie, doch unter den 17 Mitgliedern gibt es noch andere, wichtige Enzyme über die noch relativ wenig bekannt ist. ARTD4 etwa trägt als einzige ARTD die katalytische Domäne nah am N-Terminus. In der Zelle liegt ARTD4 entweder frei oder assoziiert mit den ebenfalls wenig erforschten Vault-Ribonukleoproteinpartikeln vor. Vaults werden immer wieder mit der Resistenz gegen Chemo- und Strahlentherapie in Verbindung gebracht. Ziel des Projektes war es mit Hilfe von kleinen Antigen-bindenden Domänen, sogenannten Nanobodies (bzw. DARPins), ARTD4 strukturell und funktionell zu charakterisieren. Insgesamt wurden dafür mehr als 200 unterschiedliche ARTD4-Konstrukte exprimiert und gereinigt, um gegen diese dann mögliche Binder aus drei verschiedenen Nanobody- Bibliotheken zu screenen. Nach der profunden Charakterisierung der Interaktionen blieben fünf vielversprechende Bindungskandidaten übrig, die zum Teil Affinitäten im sub-µM-Bereich zeigen. In Co-Kristallisationsexperimenten mit ARTD4+DARPin +/- Inhibitoren wurden mehr als 24 Komplexe untersucht und dabei 12 Hits ausgewertet. Schließlich konnte die Struktur der katalytischen Domäne von ARTD4 experimentell bestimmt werden. Wegen diverser Rückschläge wird das Projekt etwas länger dauern als geplant, aber die Ergebnisse verlieren nicht an Bedeutung: Die Charakterisierung von ARTD4 wird helfen die Vault-Komplexe besser zu verstehen, mit dem langfristigen Ziel, Therapien gegen die Vaultassoziierte Behandlungsresistenzen zu entwickeln.
