GWAS-driven targeted resequencing of candidate genes to assess the impact of rare and low-frequency coding variation in restless legs syndrome
Clinical Neurology; Neurosurgery and Neuroradiology
Final Report Abstract
Wir sequenzierten Exons und Promotoren von 84 Genen in 4.649 Patienten mit Restless-Legs-Syndrom (RLS) und 4.982 populationsbasierten Kontrollen. Die Gene wurden ausgewählt auf Grundlage einer annotierten genomweiten Assoziationsstudie (GWAS) und einer ExomeChip-Studie. Zur Sequenzierung verwendeten wir eine Targeted-Next-Generation-Sequencing-Technologie, die auf Molecular-Inversion-Probes (MIP) beruht. Dabei erfolgt eine Unterteilung der Ziel-Segmente (z.B. Exons) in kurze, überlappende Einzelsegmente, sog. „Targets“, die durch entsprechende MIPs amplifiziert und sequenziert werden können. In der Analyse verglichen wir die Last an seltenen Varianten pro Gen zwischen Fällen und Kontrollen mittels BRTV („burden of rare variant test“). Entgegen der ursprünglichen Planung war eine Validierung der Ergebnisse der Fall-Kontroll-Studie in einer unabhängigen Studie mit familienbasiertem Design (Segregation in Familien oder Analysen in Trios oder affected sib pairs) mittels Sanger-Sequenzierung nicht möglich. Es konnte im Rahmen des Projektes keine ausreichende Anzahl entsprechender Samples rekrutiert werden. Daher entwickelten wir eine bioinformatische Alternativmethode: BIPEDAL. Diese weist Charakteristika einer indirekten, konzeptionellen Replikation auf. Im Prinzip vergleicht BIPEDAL die Last an niedriger Sequenziertiefe der Targets eines Gens zwischen Fällen und Kontrollen, und greift damit die Idee des BRVT auf. Die Sequenziertiefe hängt von zu Grunde liegenden genetischen Varianten ab. Damit sind Rückschlüsse möglich auf genetische Unterschiede zwischen Fällen und Kontrollen. Diese im Rahmen des Projektes entwickelte Methode ist auf andere, auch bereits veröffentlichte Studien ähnlicher Datengrundlage anwendbar. Somit erweitert unsere Studie das für die Analyse von MIP-basierten Sequenzdaten verfügbare Portfolio von Analysemethoden. Auf diese Weise identifizierten wir 14 Gene als mit RLS assoziiert: AAGAB, ATP2C1, CNTN4, COL6A6, CRBN, GLO1, NTNG1, STEAP4, VAV3, BBS7, CADM1, CREB5, NRG3, SUN1. Eine Feinkartierung der Assoziationssignale war bei 12 Genen erfolgreich. Diese Signale lagen nicht nur in regulatorischen Promotorsequenzen, sondern zu 68% in codierenden Bereichen, darunter funktional wichtige Domänen in VAV3, ATP2C1, GLO1, und CREB5. Das Ergebnis ist ein Fortschritt zu den bisherigen GWAS-Resultaten, denn unsere Studie analysierte potentiell funktionale Bereiche von Genen, was der Interpretation der Kausalität näher kommt, als einzelne Varianten aus einer GWAS, die nicht ohne Weiteres einem Gen zugeordnet werden können. Damit stellt unsere Studie den nächsten Schritt zur funktionalen Studie der ermittelten Gene im Bezug zur Pathophysiologie des RLS dar. Seltene genetische Varianten können stark stratifiziert sein, wenn Fälle und Kontrolle aus unterschiedlichen Populationen stammen (z.B. aus unterschiedlichen geographischen Räumen). Wir konnten zeigen: 1) Die Effektstärken unterscheiden sich zwischen funktionalen Klassen der Varianten (z.B. intronischen Varianten vs. Missense-Varianten). 2) Die Gen-basierten p-Werte sind keine reine Funktion der Gengröße. 3) Die Sequenziertiefe der Targets war grundsätzlich balanciert zwischen Fällen und Kontrollen. Dies alles spricht gegen rein artifizielle Ergebnisse und damit gegen Populationsstratifikation.
