Metabolic engineering der Bäckerhefe für eine effizientere respiratorische und fermentative Glycerolverwertung

• Antragstellerin: Professorin Dr. Elke Nevoigt
• Fachliche Zuordnung: Bioverfahrenstechnik
• Förderung: Förderung seit 2015
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 280177596

Glycerol ist attraktiv als Rohstoff für mikrobielle Fermentationen wegen seines relativ hohen Reduktionsgrades. Letzteres ist verbunden mit höheren theoretischen Ausbeuten von reduzierten kleinen Molekülen. Außerdem erlaubt der höhere Reduktionsgrad die Fixierung von CO2 in sogenannten Mixed Substrate Conversions für die mikrobielle Produktion von organischen Säuren. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist ein beliebter Produktionsorganismus wegen seiner Robustheit in industriellen Prozessen. Vor allem die Fähigkeit von pilzlichen Organismen, bei relativ niedrigen pH-Werten zu wachsen, ist attraktiv für die Produktion von organischen Säuren. Im Rahmen eines vorherigen Projektes wurden deutliche Fortschritte hinsichtlich der Verbesserung der Glycerolverwertung der Hefe S. cerevisiae in synthetischem Medium erzielt. Durch genetische Modifikationen konnte eine Wachstumsrate von 0,26 h-1 für den häufig genutzten Laborstamm CEN.PK in synthetischem Medium mit Glycerol als einziger Kohlenstoffquelle erreicht werden, Bedingungen, unter denen der Wildtyp kein Wachstum aufweist. Der etablierte NAD-abhängige Glycerolkatabolismus erlaubt die Redoxfaktor-neutrale Produktion von Bernsteinsäure (Succinat/SA) durch den sogenannten reversen TCA Weg (rTCA Weg), der mit einer Fixierung von CO2 einhergeht. Wir haben unseren Glycerol-verwertenden S. erevisiae Stamm mit dem rTCA Weg, einer erhöhten Pyruvatcarboxylase-Aktivität und einem heterologen Transporter für den Transport organischer Säuren ausgestattet. Der beste Stamm produzierte SA (und eine geringere Menge von Malat) aus Glycerol mit einer maximalen Gesamtausbeute organischer Säuren, die 61.5% der maximalen theoretischen Ausbeute entspricht. Die Abgasanalyse in kontrollierten Bioreaktoren mit CO2-angereicherter Gasphase bestätigte, dass der konstruierte Stamm über den Verlauf der Fermentation zu einem Nettoverbrauch an CO2 führte (CO2-negativer Prozess). Obwohl die bisherigen Ergebnisse sehr vielversprechend sind, bleibt die Herausforderung bestehen, dass der bisher genutzte Stoffwechselweg ATP verbraucht (netto), wenn anaerobe Bedingungen zu Grunde gelegt werden. Hinzu kommt, dass der Export von SA und die Bemühungen der Zelle, SA außerhalb der Zelle zu akkumulieren, viel ATP benötigen. Daher muss ein Teil des Kohlenstoffs in den oxidativen TCA Zyklus (oxTCA) eintreten, um die Produktion von ausreichend ATP für Erhaltung und Wachstum zu gewährleisten. Das hier vorgeschlagene Projekt hat zwei Hauptziele. Zum einen soll die generelle ATP-Bilanz verbessert werden, um die Abhängigkeit der Zellen vom oxTCA bzw. der Atmung zu verringern. Ein spezieller Fokus soll dabei auf die ATP-verbrauchenden Prozesse während des Transports und die anaplerotischen Reaktionen gelegt werden. Das zweite Ziel ist es, den Kohlenstofffluss in den oxTCA zu feinregulieren, um die energetischen und anabolischen Bedürfnisse der Zellen zu erlauben, aber nicht mehr Kohlenstoff zu verlieren als nötig.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen