Entwicklung einer Methode zur Identifizierung von Proteinen mit zellulärer Auflösung basierend auf bildgebender Massenspektrometrie von Gewebeschnitten nach enzymatischem Verdau

• Antragsteller: Professor Dr. Andreas Römpp
• Fachliche Zuordnung: Analytische Chemie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 270010082

Die Untersuchung der räumlichen Verteilung von Proteinen mit Hilfe der bildgebenden Massenspektrometrie (MS imaging) liefert wichtige Informationen über physiologische und pathologische Prozesse. Ein entscheidender Nachteil dieser Methode ist, dass Proteinsignale oft nicht identifiziert werden können, sondern lediglich als m/z-Werte angegeben werden. Ein alternativer Ansatz ist der enzymatische Verdau direkt auf Gewebeschnitten und die anschließende Analyse der entstehenden Peptide (üblicherweise mit 100-200 µm Pixelgröße). Meine Arbeitsgruppe hat für tryptische Peptide die ersten MS Imaging-Messungen mit akkuraten Massen (3 ppm RMS-Abweichung) und 50 µm Pixelgröße veröffentlicht. Dadurch konnte die Zuverlässigkeit der Proteinidentifizierung und die Detektion kleinräumiger histologischer Strukturen wesentlich verbessert werden. Das Hauptziel dieses Antrags ist es, eine Methode zu entwickeln, die eine zuverlässige Identifizierung und eine räumliche Analyse von Proteinen im Bereich einzelner Zellen erlaubt. Ziele für MS Imaging von tryptischen Peptiden sind: a) die räumliche Auflösung auf 10 µm Pixelgröße zu verbessern b) eine zuverlässige Identifizierung durch akkurate Massenbestimmung c) die Anzahl identifizierter Proteine durch komplementäre Methoden zu erhöhen d) Präparationsprotokolle für verschiedene Gewebetypen zu erstellen und e) effiziente Datenauswertung zu entwickeln Diese Ziele sind eng verknüpft und sollen in vier Arbeitspaketen (WP) bearbeitet werden. WP1 - Probenvorbereitung: Die räumliche Auflösung ist nicht primär durch instrumentelle Parameter begrenzt, sondern im Wesentlichen von der Probenpräparation abhängig. Darum sollen die Prozesse der Trypsin- und Matrixauftragung systematisch untersucht werden. WP2 - MS-Messungen: Alle relevanten Parameter der MS Imaging-Messungen werden optimiert, um eine bessere Nachweisempfindlichkeit und aussagekräftigere MS/MS-Experimente zu erhalten. Zusätzliche Daten werden mit Hilfe von LC-MS/MS und MS imaging von intakten Proteinen gewonnen. WP3 - Bewertung und Interpretation: Die räumliche Auflösung wird anhand des Vergleichs mit histologischen Färbemethoden beurteilt. Zur Identifizierung werden akkurate Massen von Peptiden aus MS imaging und LC-MS/MS verknüpft. Ergänzt wird dieser Ansatz durch komplementäre Daten aus MS imaging intakter Proteine. Basierend auf dem Standardformat imzML werden neue Strategien zur Datenauswertung entwickelt. WP4 - Anwendungsbeispiele: Die Methodenentwicklung wird an Hand von Mausgewebe durchgeführt. Die optimierten Methoden werden auf humane Tumorbiopsien angewendet, um die verbesserte analytische Leistungsfähigkeit und die Anwendbarkeit für klinisch-relevante Proben zu demonstrieren. Das längerfristige Ziel dieses Ansatzes ist es, eine Methode zu entwickeln, die es erlaubt Proteine in einzelnen Zellen räumlich abzubilden und gleichzeitig zu identifizieren. Dies ist mit bisherigen Methoden (ohne zusätzliche Information) nicht möglich.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen