Untersuchungen zur Rolle der alox15 und ihrer Produkte bei der experimentellen Kolitis in der Maus.
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Lipoxygenasen (ALOXs) sind an der Regulation der zellulären Redoxhomöostase beteiligt und spielen auch für die Biosynthese von pro- und anti-inflammatorischen Lipidmediatoren bei der Pathogenese entzündlicher Erkrankungen eine Rolle. Um die pathophysiologische Rolle der murinen Alox15 bei der experimentellen Kolitis der Maus zu untersuchen, haben wir zunächst den Einfluss der systemischen Inaktivierung des Alox15-Gens auf das Ausmaß der durch Dextransulfat-Natrium (DSS)-induzierten Kolitis getestet. Wir fanden heraus, dass in Wildtyp- Mäusen die Expression des Alox15-Gens im Colon während der DSS-Colitis verstärkt war, während die Expression anderer Alox-Gene (Alox5, Alox15b) sich nicht veränderte. Ein systemischer Alox15-Mangel führte zu weniger schweren Kolitis-Symptome und unterdrückte in vivo die Bildung von 12-Hydroxyeicosatetraensäure (12-HETE), dem Hauptprodukt der murinen Alox15. Diese Veränderungen gingen einher mit einer verringerten Expression entzündungsfördernder Genprodukte, einer geordneteren apikalen Expression des Zonulaoccludens-Proteins 1 (ZO-1) und einer weniger beeinträchtigten intestinalen epithelialen Barrierefunktion. In-vitro Inkubationen von Kolonepithelzellen konnten zeigen, dass Zugabe von 12S-HETE die Barrierefunktion signifikant senkte und damit 12-HETE als mögliche Ursache eines Barriereschadens im entzündeten Darm etablieren. Für mehrfach ungesättigte omega-3-Polyenfettsäure (n-3 PUFA) wurden in verschiedenen Studien entzündungshemmende Wirkungen beschrieben. Um die Rolle der Alox15 im Kontext erhöhter n-3 PUFAs zu untersuchen, wurden transgene fat1 Mäusen (erhöhte endogen Konzentrationen an n-3-PUFAs) mit Alox15-defizienten Tieren gekreuzt und in zwei unabhängigen experimentellen Maus-Colitis-Modellen getestet. Transgene fat1-Mäuse sind, wie bereits in Voruntersuchungen gezeigt werden konnte, vor Kolitis geschützt. Eine zusätzliche systemische Inaktivierung des Alox15-Gens hob diesen Schutzeffekt jedoch fast vollständig auf. Um die molekulare Basis für diesen Effekt zu untersuchen, wurden Alox15- Lipidmetaboliten, die sich von n-3-PUFA abgeleiten, in den verschiedenen Mäusen analysiert. Der Alox15-Knockout unterdrückte die Bildung von 15-Hydroxy-Eicosapentaensäure (15- HEPE) aus der n-3-PUFA Eicosapentaeinsäure (EPA). Dagegen konnten wiederholte intraperitonealen Injektionen von 15-HEPE Wildtyp-Mäuse gegen Kolitis schützen. Diese Daten legen nahe, dass der Anti-Colitis-Effekt von transgenen Expression von fat1 über Alox15-abgeleitetes 15-HEPE vermittelt wird. In Anbetracht der Tatsache, dass 15-HEPE auch das Hauptoxidationsprodukt der humanen ALOX15 mit EPA ist, sollte dieser Schutzmechanismus auch auf den Menschen übertragbar sein. ALOX5-Orthologe von Säugetieren sind pro-inflammatorische Enzyme, da sie als Schlüsselenzyme bei der Biosynthese von Leukotrienen fungieren. Im Gegensatz dazu werden ALOX15 Orthologen anti-entzündliche Wirkungen zugeschrieben, da diese Enzyme an der Synthese von pro-resolutorischen Lipoxinen, Resolvinen und Maresinen beteiligt sind. In Voruntersuchungen haben wir herausgefunden, dass die gezielte Mutation der Triadendeterminanten (3 Punktmutationen) der murinen ALOX5 die Reaktionsspezifität des Enzyms so verändert, dass keine Leukotriene mehr gebildet werden können. Im Gegensatz dazu ist das mutierte Enzym in der Lage, 15-HETE und 13-HODE zu bilden, die anschließend in Lipoxine und Resolvine umgewandelt werden können. Um herauszufinden, ob diese minimale gentechnische Veränderung des Alox5 Gens zu einer veränderten Sensitivität der Alox5-knock-in Mäuse in verschiedenen murinen Entzündungsmodellen führt, wurden diese Tiere in 3 unterschiedlichen Entzündungsmodellen getestet. Alox5-KI Mäuse entwickelten im Vergleich zu ausgekreuzten Wildtypkontrollen im DSS-Kolitis Modell weniger schwere Entzündungssymptome. Im Gegensatz dazu waren Alox5-KI Mäuse im EAE- Enzephalomyelitis Modell sensitiver als Kontrollmäuse und entwickelten schwerere Krankheitssymptome. Im ICC-Model des neuropathischen Schmerzes gab es keine Unterschiede zwischen den beiden Genotypen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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