Konfokalmikroskop
Final Report Abstract
Die genaue Kenntnis der Vernetzung spezifischer Neurone im Kontext neuronaler Netzwerke ist eine Voraussetzung für ein besseres Verständnis der gerichteten Ausbreitung elektrischer Signale in diesen Netzwerken. Um diesem Ziel näher zu kommen entwickelten wir Systeme, die es uns erlauben selektiv unterschiedliche Neuronentypen mit modifizierten Tollwutviren zu infizieren. Dazu haben wir rAAVs entwickelt, die sowohl den Rezeptor für eine erfolgreiche Tollwutvirusinfektion (TVA), als auch das Tollwutvirus Glycoprotein, für den transsynaptischen Transport exprimieren. Die stereotaktische Injektion beider Viren in entsprechende Gehirnareale von Mäusen erlaubt dann die Sichtbarmachung der afferenten Vernetzungsmuster dieser Neuronen. Tollwutviren sind zum retrograden transsynaptischen Transport fähig, was in Verbindung mit der Expression von Fluoreszenzproteinen afferenten Vernetzungsmuster sichtbar machen kann. Diese Technologie ermöglicht es die Integration von transplantierten Zellen (lt-NES) in das neuronale Netzwerk von Mäusen zu untersuchen. Dazu wurden die zu transplantierenden lt-NES Zellen mit mRFP1 transfiziert und anschließend stereotaktisch in das Gehirn der Mäuse injiziert. Nachdem die transplantierten Zellen Zeit hatten sich in das Netzwerk zu integrieren wurden GFP-exprimierende Tollwutviren (RABVΔG-EGFP(EnvA)) ebenfalls in das Gehirn injiziert, um ein Tracing der Zellverbindungen zu ermöglichen. Um das ganze Netzwerk aufnehmen zu können, wurden die Gehirne zusätzlich mit Benzylalkohol/Benzylbenzoat (BABB) durchsichtig gemacht (Clearing). Durch das BABB-Clearing werden Lipide aufgelöst und es wird möglich ganze Gehirne von Mäuse intakt zu mikroskopieren. Die technische Ausstattung des Mikroskops mit entsprechenden Objektiven mit großem Arbeitsabstand und BABB-Kompatibilität ermöglicht die Aufnahmen großer Gewebevolumen in BABB, wodurch große Netzwerke in hoher Auflösung untersucht werden können. In einem anderen Projekt wurde ein zwei-Komponenten-Silencer System etabliert, wofür eine lichtaktivierte Adenylatzyklas (PAC) und ein durch cyclische Nukleotide gesteuerter Kalium-Kanal (SthK) in Kardiomyozyten und Neuronen exprimiert wurden. Kurze Lichtpulse mit blauem Licht führen dann zur Öffnung des Kaliumkanals und zur Hyperpolarisation der Zelle. Während der elektrophysiologischen Charakterisierung der Zellen wurde gezeigt, dass dieses System zu einem robusten und reversiblen Silencing Kardiomyozytenerregung bzw. der Feuerraten der Nervenzelle führte. Die gepatchten Zellen wurden mit Biocytin gefüllt und anschließend fixiert. Die Färbung der Biocytin-gefüllten Zelle mit einem Fluoreszenzmarkierten Antikörper ermöglicht die konfokale Mikroskopie der zuvor elektrophysiologisch charakterisierten Zelle. In Kombination mit rotem Licht-absorbierenden Channelrhodopsinen ist somit eine bimodale Kontrolle der neuronalen Aktivität durch Lichtstimulation möglich. Bei der Entwicklung und dem Fortschreiten der mesial Temporallappenepilepsie werden dysfunktionalen Astrozyten eine zunehmend zentrale Rolle zugesprochen. Eine dramatische Veränderung stellt in diesem Zusammenhang der Verlust von gap junctions dar. Um die molekularen Mechanismen für diese Veränderungen genauer zu verstehen wurden Expression, subzelluläre Lokalisation und Phosphorylierungsstatus der gap junctions untersucht. Dazu wurden 20 bzw. 60µm Gewebeschnitte angefertigt, die mit drei unterschiedlichen fluoreszenten Sekundärantikörpern und Primärantikörpern gegen Connexin (Cx43), S100B, NG2 und/oder CD31 markiert wurden. Mit dem konfokalen Mikroskop wurden dann Stacks mit 1µm Schrittweite aufgenommen. Außerdem wurden einige Proben mittels Expansion Microscopy vergrößert, um auf diese Weise eine Auflösungsverbesserung mit dem Mikroskop zu erhalten. So konnte gezeigt werden, dass die totalen Cx43-Proteinlevel in sklerotischen Hippocampi erhöht waren, wobei es keinen Unterschied in Bezug auf die Membranlokalisation gab. Durch Expansion Microscopy wurde gezeigt, dass Cx43 sich in unter sklerotischen Bedingungen verstärkt an den Endfüßen der Astrozyten befindet, die die Blutgefäße umschließen. Die Untersuchungen zeigen, dass die reduzierte Kopplung von Astrozyten gab junctions kein Resultat einer verringerten Expression von Cx43 sind. Seit 2017 wurde das Mikroskop außerdem in die Mikroskopie Core Facility aufgenommen und so noch weiteren Wissenschaftlern zugänglich gemacht. In diesem Zusammenhang wurden dann auch Aufnahmen von Ratten Retinas (ca. 1cm Durchmesser) angefertigt. Die Zahl der Nutzer und die Nutzung generell wurden nach der Integration in die Core Facility stetig erhöht. Nun mehr nutzen 40 Nutzer aus 16 Arbeitsgruppen (12 Institute) das Mikroskop. Aufgrund dieses Umfangs ist eine detaillierte Darstellung aller Projekte in dieser Beschreibung daher nicht möglich; die oben beschriebenen Projekte dienen daher als exemplarische Auswahl. Zum Zeitpunkt dieses Berichts ist das Mikroskop eines der am meisten genutzten konfokalen Mikroskope in der Core Facility.
Publications
- „Locomotion, Theta Oscillations, and the Speed-Correlated Firing of Hippocampal Neurons Are Controlled by a Medial Septal Glutamatergic Circuit“ Neuron Volume 86, Issue 5, (2015)
Falko Fuhrmann, Daniel Justus, Liudmila Sosulina, Hiroshi Kaneko, Tatjana Beutel, Detlef Friedrichs, Susanne Schoch, Martin Karl Schwarz, Martin Fuhrmann, Stefan Remy
(See online at https://doi.org/10.1016/j.neuron.2015.05.001) - „Dysfunction of Somatostatin-Positive Interneurons Associated with Memory Deficits in an Alzheimer’s Disease Model“ Neuron Volume 92, Issue 1, (2016)
Lena C. Schmid, Manuel Mittag, Stefanie Poll, Julia Steffen, Jens Wagner, Hans- Rüdiger Geis, Inna Schwarz, Boris Schmidt, Martin K. Schwarz, Stefan Remy, Martin Fuhrmann
(See online at https://doi.org/10.1016/j.neuron.2016.08.034) - „Glutamatergic synaptic integration of locomotion speed via septoentorhinal projections“ Nature Neuroscience volume 20, pages 16–19 (2017)
Daniel Justus, Dennis Dalügge, Stefanie Bothe, Falko Fuhrmann, Christian Hannes, Hiroshi Kaneko, Detlef Friedrichs, Liudmila Sosulina, Inna Schwarz, David Anthony Elliott, Susanne Schoch, Frank Bradke, Martin Karl Schwarz & Stefan Remy
(See online at https://doi.org/10.1038/nn.4447) - „Subcellular reorganization and altered phosphorylation of the astrocytic gap junction protein connexin43 in human and experimental temporal lobe epilepsy.“ Glia Nov;65(11):1809-1820 (2017)
Deshpande T, Li T, Herde MK, Becker A, Vatter H, Schwarz MK, Henneberger C, Steinhäuser C, Bedner P
(See online at https://doi.org/10.1002/glia.23196) - „Whole-brain 3D mapping of human neural transplant innervation“ Nature Communications, Volume 8 (2017)
Jonas Doerr, Martin Karl Schwarz, Dirk Wiedermann, Anke Leinhaas, Alina Jakobs, Florian Schloen, Inna Schwarz, Michael Diedenhofen, Nils Christian Braun, Philipp Koch, Daniel A. Peterson, Ulrich Kubitscheck, Mathias Hoehn & Oliver Brüstle
(See online at https://doi.org/10.1038/ncomms14162) - „Potassium channel-based optogenetic silencing.“ Nature Communications, Volume 9 (2018)
Bernal-Sierra, Y-A., Rost, B.R., Pofahl, M., Fernandes, A.M., Kopton, R.A., Holtkamp, D., Masala, N., Beed, P., Tukker, J.J., Oldani, S., Bönigk, W., Kohl, P., Baier, H., Schneider- Warme, F., Hegemann, P., Beck, H., Seifert, R., Schmitz, D.
(See online at https://doi.org/10.1038/s41467-018-07038-8)
