Weiterführende Analyse der mitotischen Spindelarchitektur in Säugerzellen

• Antragsteller: Professor Dr. Thomas Müller-Reichert
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biophysik
• Förderung: Förderung seit 2014
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 258577783

Die mitotische Spindel ist ein dreidimensionaler (3D), Mikrotubuli (MT)-basierter Apparat, der während der Zellteilung für eine präzise Verteilung der Chromosomen genutzt wird. In vorhergehenden Rekonstruktionen von HeLa-Zellen in der Metaphase konnten wir zeigen, dass die Chromosomen in dieser menschlichen Zelllinie in einer semi-direkten Weise mit den Spindelpolen verbunden sind. Die Bündel der Kinetochormikrotubuli (KMTs; engl.: k-fibers) zeigten dabei eine Verbreiterung an ihren spindelpolnahen Enden, wahrscheinlich um eine Verankerung der KMTs mit dem MT-Netzwerk zu erreichen. Wir konnten weiterhin zeigen, dass die KMTs in der Metaphase definierten MT-Ordnungslinien folgen. Es ist nun unser Ziel, unsere strukturellen Analysen auf eine zweite Zelllinie auszuweiten, nämlich auf RPE1-Zellen, um so Ähnlichkeiten und Unterschiede in der Spindelorganisation zweier Säugerzellsysteme herausarbeiten zu können. Für die vorgeschlagenen Projekte wird ein vollständig etablierter Ansatz zur Anwendung kommen. Mittels Hochdruckgefrierung, serieller Elektronentomographie und Quantifizierung der Längenverteilung der MTs sollen RPE1-Spindeln in Metaphase in 3D rekonstruiert werden. Erste 3D-Rekonstruktionen haben gezeigt, dass die RPE1-Zellen im Gegensatz zu den HeLa-Zellen eine erhöhte Anzahl an spindelpolassoziierten KMTs zeigen. Die KMTs in RPE1-Zellen, wie aus lichtmikroskopischen Analysen ersichtlich, sind zudem stabiler. Im Gegensatz zu den HeLa-Zellen sind die Metaphasespindeln in RPE1-Zellen auch weniger abgerundet. Parallel dazu soll auch die Ultrastruktur der KMT-Bündel in monopolaren Spindeln untersucht werden. Unerwarteterweise konnten wir eine „Minispindel“ in jeder monopolaren Zelle beobachten, die von radiär nach außen gerichteten MTs umgeben ist. Die KMTs scheinen dabei von den peripher angeordneten Chromosomen aus zum Zentrum der Spindel und entlang definierter, astral angeordneter MT-Ordnungslinien zu wachsen. Weiterhin scheint die Mehrheit der KMTs an der Grenzlinie zwischen MT-Aster und „Minispindel“ zu enden, so dass die KMTs nicht mit den Zentrosomen assoziiert sind. Wir werden monopolare RPE1-Spindeln auch nutzen, um eine Umorganisation der MTs hin zu einer bipolaren Spindel hin zu induzieren. Eine Analyse dieser MT-Umorganisation wird zu einem besseren Verständnis der Bildung der definierten MT-Ordnungslinien beitragen. Insgesamt sollen die neu gewonnen Strukturdaten für eine Weiterentwicklung unseres biophysikalischen Modells zur Selbstorganisation der KMT-Bündel in Säugerzellen genutzt werden. In Einklang mit den FAIR-Prinzipien (Auffindbarkeit, Zugänglichkeit, Interoperabilität, Wiederverwendbarkeit) soll zudem in einem Pilotprojekt ein nachhaltiges Datenmanagementsystem für die gewonnenen tomographischen Modelle etabliert werden. Schließlich sollen weitere Visualisierungsmöglichkeiten entwickelt werden, damit die erzielten Ergebnisse innerhalb der Wissenschaft und auch in der Öffentlichkeit besser kommuniziert werden können.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen