Funktionelle Mechanismen von spezifischen Proteinen prä-katalytischer B-Komplex Spleißosomen beim konstitutiven und alternativen Spleißen

• Antragsteller: Professor Dr. Reinhard Lührmann; Professor Dr. Markus C. Wahl
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 257515868

Für jeden prä-mRNA Spleißvorgang wird ein Spleißosom neu durch schrittweise Rekrutierung von snRNP und nicht-snRNP Untereinheiten assembliert. Spleißosomen höherer Eukaryonten umfassen ca. 80 Faktoren, die in niederen Eukaryonten (wie Hefe) nicht vorkommen und die vermutlich für die Implementierung des alternativen Spleißens benötigt werden. Während die initiale Spleißstellenerkennung durch die Kernmaschinerie festlegt, dass ein Substrat gespleißt wird, wird die Entscheidung über ein spezifisches Spleißmuster erst zu einem späteren Zeitpunkt getroffen. Wichtig dabei ist vermutlich die Umwandlung eines initialen Exon-umspannenden in einen Intron-umspannenden Komplex, ein Aspekt des bevorzugten Assemblierungswegs in höheren Eukaryonten. Zu diesem Zeitpunkt wird eine Gruppe von neun Proteinen eingebaut, die im direkt folgenden Schritt der katalytischen Aktivierung des Spleißosoms wieder entlassen wird, und die daher von besonderem Interesse für die Regulation des alternativen Spleißens ist. Die meisten dieser B-spezifischen Proteine sind in Hefe nicht vorhanden. Nach derzeitiger Datenlage könnten die B-spezifischen Proteine dazu dienen, das U4/U6-U5 tri-snRNP stabil zu integrieren oder andere Intermediat-spezifische Proteine (Bact-spezifische, Prp19 und/oder Prp19-verwandte Proteine, von denen wiederum einige in Hefe fehlen) zu rekrutieren. Interaktionen der B-spezifischen Proteine könnten auch als Kontrollpunkte dienen, die vor der katalytischen Aktivierung des Spleißosoms durchlaufen werden müssen. B-spezifische Proteine könnten so die Festlegung eines bestimmten Spleißmusters beeinflussen und verschiedene alternative Spleißprozesse könnten in unterschiedlicher Weise von B-spezifischen Proteinen abhängen. Die molekularen Mechanismen, über die B-spezifische Proteine ihre vermuteten Funktionen entfalten, sind derzeit jedoch nicht bekannt. Daher schlagen wir hier eine kombinierte biochemische, strukturelle und funktionelle Analyse B-spezifischer Proteine vor. Wir wollen untersuchen, mit welchen Proteinen und mit welchen prä-mRNA Bereichen B-spezifische Proteine in präkatalytischen Spleißosomen in Kontakt stehen. Darüber hinaus sollen die atomaren Strukturen von Komplexen B-spezifischer Proteine aufgeklärt und Varianten der Proteine hergestellt werden, bei denen bestimmte Interaktionen gestört sind oder denen bestimmte funktionelle Bereiche fehlen. Wir werden den Einfluss B-spezifischer Proteine auf konstitutives und alternatives Spleißen über Immundepletion/Knock-down testen und ihre Bedeutung für die Umwandlung eines Exon-umspannenden in einen Intron-umspannenden Komplex analysieren. Wildtyp und dysfunktionale Varianten B-spezifischer Proteine sollen für Rettungsexperimente genutzt werden, um Eigenschaften dieser Proteine zu identifizieren, die für die Beeinflussung von Spleißvorgängen wichtig sind. Die erwarteten Ergebnisse werden zu unserem Verständnis des Spleißosoms und der Prinzipien des alternativen Spleißens beitragen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen