Heterocyclic aromatic amines: Microbial metabolism and interaction with fruit and vegetable dietary fiber
Final Report Abstract
Ziel des Projektes war die Untersuchung der Metabolisierung von lebensmittelrelevanten heterozyklischen aromatischen Aminen (HAA) durch die humane Fäzesmikrobiota. Zudem sollten mikrobielle HAA-Metaboliten einer ersten ernährungstoxikologischen Charakterisierung unterzogen sowie Interaktionen zwischen HAA, der Darmmikrobiota und Obst- und Gemüse-Ballaststoffen untersucht werden. Da für PhIP ein durch die Reaktion mit dem bakteriell aus Glycerin gebildeten Multikomponentensystem Reuterin entstehender Metabolit bekannt war und eigene Vorversuche zeigten, dass andere HAA analog metabolisiert werden können, wurde die Reaktivität von IQ, MeIQx, MeIQ, AαC, Trp-P-1, Harman, Norharman gegenüber Reuterin im ersten Schritt in einem einfachen Modell untersucht. Hierzu wurden die HAA mit Lactobacillus reuteri DSM 20016 und Glycerin bei zwei verschiedenen Glucose/Glycerin-Verhältnissen (nGlc/nGly) inkubiert. Es konnte gezeigt werden, dass die HAA-Umsetzung strukturspezifisch ist und Vertreter mit exozyklischer Aminogruppe und α-Carbolin- bzw. 2-Aminoimidazo-Grundstruktur bevorzugt metabolisiert werden. Daneben hatte auch das nGlc/nGly einen Einfluss auf die Umsetzung und das Metabolitenprofil. Mithilfe von hochauflösender Massenspektrometrie wurden neben einfachen Reuterinkonjugaten, die für alle untersuchten HAA nachweisbar waren, zusätzlich auch Reuterinkonjugate detektiert, die formal durch die Reaktion mit zwei Acrolein-Molekülen entstehen. Außerdem gelang es die Strukturen von drei, z. T. instabilen AαC-Reuterin-Konjugaten mittels geeigneter Isolations- und Analysetechniken aufzuklären. Im Anschluss sollte der HAA-Metabolismus durch die humane Darmmikrobiota in einem physiologisch relevanteren Modell untersucht werden. Dazu wurden MeIQx, MeIQ, AαC, Trp-P-1, Harman, Norharman und PhIP mit Fäzessuspensionen unterschiedlicher Donoren mit und ohne Glycerinzusatz inkubiert. Dabei konnte die glycerin- und strukturabhängige Metabolisierung von HAA bestätigt werden. Es wurden z. T. deutlich komplexere Metabolitenprofile als im L. reuteri-Modell erhalten. Neben unmodifizierten Reuterinkonjugaten wurden vermehrt auch davon abgeleitete reduzierte bzw. hydroxylierte Derivate detektiert. Für ausgewählte HAA wurden auch monohydroxylierte HAA-Derivate identifiziert, was bestätigt, dass die humane Fäzesmikrobiota HAA nicht nur durch reuterininduzierte Umwandlungen und Folgetransformationen, sondern auch durch direkte Hydroxylierung metabolisieren kann. Dies stellt eine unübliche Metabolisierungsreaktion der Darmmikrobiota dar und wurde bislang nur für IQ berichtet. Die beobachteten donorspezifischen Unterschiede deuten an, dass interindividuelle Unterschiede in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota, und vermutlich v. a. im Potential zur Reuterinproduktion, beim mikrobiellen HAA-Metabolismus im Menschen von Bedeutung sein könnten. Unlösliche Ballaststoffe aus Kiwi, Birne und Radieschen wurden durch humane Fäzesmikrobiota teilweise fermentiert, wobei vor allem Polysaccharide und insbesondere Pektine abgebaut wurden. Der nicht-fermentierte Rückstand war zudem angereichert in Lignin. Bindungsstudien, in denen physiologische Bedingungen simuliert wurden, bestätigten größtenteils, dass die Adsorption an Ballaststoffe mit steigender Lipophilie der HAA zunimmt. Zudem adsorbierten die untersuchten HAA stärker an Obstund Gemüse-Ballaststoffe, nachdem diese fermentiert wurden. Dies kann vor allem auf die höheren Ligningehalte der fermentierten Ballaststoffe zurückgeführt werden. Zudem wurde am Beispiel von PhIP-M1 gezeigt, dass die reuterininduzierte Metabolisierung von HAA zu einer starken Zunahme der Bindung an Ballaststoffe führen kann. Ob dies auch für PhIP-M1-Analoga anderer HAA bzw. andere reuterininduzierte HAA-Metaboliten zutrifft, konnte aufgrund der beschriebenen Instabilität der Hauptmetaboliten während der Isolierung im Rahmen des Projektes nicht untersucht werden. Die Aufnahme mikrobieller HAA-Metaboliten in Caco-2-Zellen konnte aufgrund deren Instabilität nicht wie geplant untersucht werden, jedoch wurde bestätigt das PhIP-M1 ähnlich gut resorbiert wird wie PhIP. Zudem wurde erstmalig zeigt, dass AαC und MeIQ besser in Caco-2-Zellen aufgenommen werden als MeIQx, PhIP und PhIP-M1. Die Ergebnisse des Ames-Tests deuten darauf hin, dass der mikrobielle HAA-Metabolismus das mutagene Potential von HAA verändert und daher für eine ganzheitliche Bewertung des HAA-assoziierten Dickdarmkrebsrisikos berücksichtigt werden muss. Dabei könnten insbesondere reuterininduzierte Umwandlungen, im Zuge derer die exozyklische Aminogruppe blockiert wird, zu einer Detoxifizierung von HAA im Darm beitragen.
Publications
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