Das Versagen molekularer Qualitätsstempel in mitochondrialen Myopathien: Modifikationsenzyme überwachen Strukturbildung und Steady-State Level von mitochondrialer tRNA Ser(UCN)
Final Report Abstract
Das zentrale Ziel dieses Forschungsvorhabens war die Charakterisierung der Struktur und biophysikalischen Eigenschaften sowie der Degradation von Wildtyp tRNASer(UCN) und ihrer C23U Mutante in unterschiedlichen Graden der Modifikation, sowohl im Reagenzglas als auch in Zellkultur. Durch Erarbeiten einer Kausalkette, die Struktur- und Modifikationsdefekte in der Mutanten mit verringertem Steady-State Level (und ultimativ mit dem Krankheitsbild tRNA-abhängiger mitochondrialer Myopathien als Folge defekter Proteinbiosynthese) verbindet, sollten die Arbeiten das Konzept des „Qualitätsstempels“ durch Nukleotidmodifikation überprüfen. Zu diesem Zweck wurde der strukturelle Impakt der pathogenen Mutation durch UV-Schmelzkurven charakterisiert. Eine erhöhte Stabilität der Mutante wird auf eine alternative Faltung mit neuartigen tertiären Wechselwirkungen zurückgeführt, welche die Erkennung durch Modifikationsenzyme in vitro negativ beeinflussen. Durch Structural Probing wurden Nukleotide identifiziert, die bei den tertiären Wechselwirkungen eine wichtige Rolle spielen. Durch die Synthese diverser Modivarianten wurden Rückschlüsse über die Beeinflussung des Wanderungsverhaltens in nichtdenaturierender Gelelektrophorese (nd-PAGE) durch Nukleotidmodifikationen erhalten. Dies ließ eine partielle Charakterisierung der in Zellkulturen auftretenden Modivarianten von Wildtyp und Mutanten durch nd-PAGE zu, deren Populationen sich in Abhängigkeit von äußeren Faktoren wie z.B. Temperatur ändern. Eine weitergehende Charakterisierung der Modivarianten per nd-PAGE erfordert eine vollständige, vergleichende Analytik von Modifikationen in nativem Material von Wildtyp und Mutanten. Diese Analytik ist derzeit nur zu etwa drei Vierteln komplett. Prinzipiell bestätigen unsere Daten die Ausgangshypothese eines kausalen Zusammenhangs Modifikation-Struktur-metabolische Stabilität. Allerdings fehlt genau ein Bindeglied in der logischen Verknüpfung, nämlich der Nachweis von Pseudouridine an Position 55 der Wildtyp tRNA bzw. dessen Abwesenheit in der pathogenen Mutanten C23U. Zur Etablierung einer quantitativen Analytik an dieser Position werden aktuell mehrere Ansätze verfolgt, darunter die Synthese Pseudouridine-spezifischer Reagenzien, HPLC-MS und Deep Sequencing.
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