Konfokales Fluoreszenzmikroskop mit TIRF und FRAP Einheit
Final Report Abstract
Der Schwerpunkt der durchgeführten Forschungsarbeiten lag auf der Charakterisierung mitochondrieller Netzwerke. Hierfür wurde im Arbeitskreis von Prof. Düfer die Technik der Echtzeit-Mikroskopie mittels kombinierten TIRF-konfokal-Aufnahmen etabliert. Mit Hilfe der TIRF-konfokal-Mikroskopie konnte erstmals auf der Ebene einzelner Mitochondrien eine von der Lokalisation abhängige, funktionelle Heterogenität in primär kultivierten Zellen der Langerhans-Inseln (Mensch, Maus) nachgewiesen werden. Es ließ sich zeigen, dass membrannahe Mitochondrien bei Stimulation pankreatischer beta-Zellen stärker reagieren als solche, die im Zellinneren liegen. Zudem ist der Anteil aktiver Mitochondrien in Membrannähe signifikant erhöht. Dieser Unterschied im Aktivierungsgrad lässt sich sehr gut damit in Einklang bringen, dass die Kopplung von mitochondrieller ATP-Produktion und dem Schließen ATP-regulierter Kaliumkanäle der entscheidende Parameter für die Steuerung der durch Glucose ausgelösten Insulinsekretion ist. Eine stärkere Rekrutierung membrannaher Mitochondrien ermöglicht dabei die schnelle „Übersetzung“ des mitochondriellen Signals in eine graduelle Veränderung der elektrischen Aktivität. Mit Hilfe von Gradientenmessungen, die durch die hochauflösende Mikroskopie ermöglicht wurden, lies sich zeigen, dass das heterogene Verhalten der Mitochondrien nicht mit einem durch Depolarisation vermittelten intrazellulären Calcium- Gradienten korreliert ist. Untersuchungen zur Verschlechterung der beta-Zell-Funktion, die im Verlauf der Krankheitsprogression von Patienten mit Typ 2 Diabetes mellitus zwangsläufig auftritt, ergaben, dass die mitochondrielle Heterogenität mit nachlassender beta-Zell-Funktion abnimmt. Dies betrifft sowohl den Rekrutierungsgrad als auch die Aktivität der einzelnen Organellen, wenn die Zellen durch hohe Glucose- und Lipidkonzentrationen gestresst werden. Während hohe Glucosekonzentrationen alleine nur tendenzielle Veränderungen auslösen, geht die Heterogenität unter glucolipotoxischen Bedingungen vollständig verloren. Teilweise kann dieser Effekt durch Metformin, welches bei Typ 2 Diabetes mellitus Mittel der ersten Wahl ist, verhindert werden. Mit Hilfe der hochauflösenden Mikroskopie konnte dargestellt werden, dass Exendin-4, welches als GLP-1-Analogon ebenfalls in der Therapie von Typ 2 Diabetes mellitus etabliert ist, einen starken Effekt auf Zellform und Mitochondrienlokalisation hat. Dies ist im Bezug auf eine potenziell proliferationsfördernde Wirkung des Inkretinanalogons sehr spannend und wird künftig weiter untersucht. Neben der Erfassung funktioneller und morphologischer Veränderungen lässt die Gerätekonfiguration auch eine detaillierte Analyse der Mobilität von Mitochondrien zu. Unter phyiologischen Bedingungen ist die Mitochondrienbewegung in der membran- und kernnahen Region unterschiedlich. Glucolipotoxizität nimmt auch auf diesen Parameter Einfluss und steigert die Moblität membrannaher Mitochondrien. Ein weiterer Forschungsbereich, zu welchem das bewilligte Gerät einen essentiellen Beitrag liefert, liegt auf dem Gebiet der Regulation Calcium-aktivierter Kaliumkanäle. In Kooperation mit den Arbeitsgruppen von Prof. Dr. B. Wünsch (Institut für Pharmazeutische und Medizinische Chemie, Univ. Münster) und Prof. Dr. A. Schwab (Institut für Physiologie II, Univ.klinikum Münster) werden fluoreszenzmarkierte Inhibitoren des Calcium-regulierten Kaliumkanals mittlerer Leitfähigkeit, KCa3.1, getestet. Durch Hemmung von KCa3.1 lässt sich die Insulinfreisetzung potenzieren. Ob dieser Ionenkanal darüber hinaus noch andere Funktionen in beta-Zellen ausübt, ist nicht bekannt. Wir konnten mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie darstellen, dass - entsprechend unserer Hypothese - KCa3.1 nicht nur in der Plasmamembran, sondern auch an Mitochondrien nachweisbar ist. Die fluoreszierenden Inhibitoren ermöglichen nun eine Echtzeit-Beobachtung von Mitochondrienaktivität in Abhängigkeit von der Kanalfunktion. Ähnliche Untersuchungen werden mit Hilfe des bewilligten Gerätes auch zur Charakterisierung der KCa3.1- Kanäle in anderen Zelllinien (A549-3R Zellen, Arbeitsgruppe Prof. Wünsch) durchgeführt. In Kooperation mit Dr. K. Riehemann (Zentrum für Nanotechnologie, CenTech, Univ. Münster) wurde das Gerät des Weiteren genutzt, um den Einfluss von Nanopartikeln auf Makrophagen zu untersuchen. Hierbei steht im Fokus zu testen, ob der Mechanismus, über den bestimmte Nanopartikel an Makrophagen zur Reduktion des Kaliumstroms durch spannungsaktivierte Kaliumkanäle führen, regioselektive Veränderungen des Zytoskeletts beinhaltet. Neben neuen experimentellen Befunden lieferte das Gerät im Rahmen der oben ausgeführten Projekte auch wichtige methodische Erkenntnisse. So geht aus der Analyse einzelner Mitochondrien hervor, dass sich der Farbstoff Mitotracker Green (MTG) bei der Färbung von Mitochondrien primärer beta-Zellen nicht vollständig inert verhält. Die häufig angewandte Standardisierung von Messungen auf MTG (z.B. bei der Bestimmung des mitochondriellen Membranpotenzials mittels TMRE) führt gemäß unserer Daten zu einer deutlichen Unterschätzung der tatsächlichen Werte und ist daher nicht sinnvoll einsetzbar.
