Progressive Muscle Dysfunction resulting from chronic Remodeling of Cellular Architecture in inherited Muscle Diseases- Advanced Second Harmonic Generation Microcopy and quantitative Morphometry in skeletal Muscles from Animal Models of Duchenne Muscular Dystrophy and Desminopathy -
Molecular and Cellular Neurology and Neuropathology
Final Report Abstract
Ziel des Projektes war die Anwendung von modernsten Multiphotonen-Licht-Anregungen in Muskelzellen zur Identifizierung von Strukturparametern des Gewebsumbaus bei chronischen angeborenen Muskelerkrankungen aus dem Formenkreis der Myofibrillären Myopathien (Desminopathie R350P/R349P). Die Erkrankung stellt eine seltene angeborene Myopathie dar, welche mit progredienter Muskelschwäche im mittleren bis höheren Lebensalter einhergeht und durch muskuläre Desmin-positive Protein-Ablagerungen, ähnlich derer bei Parkinson-Erkrankung im Gehirn, charakterisiert ist. Hierdurch wird vermutet, dass im Verlauf der Erkrankung strukturelle Veränderungen der Zytoarchitektur betroffener Muskelzellen deren Fähigkeit zur Kraftentwicklung behindern. Zur detaillierten altersabhängigen Untersuchung der Auswirkungen der Expression mutierten Desmins wurde eine stabile Maus- Linie, welche das humane Ortholog der Mutation trägt, verwendet und über drei Jahre einzelne Muskelzellen manuell aus dem Organ von Mäusen dreier Altersgruppen (jung: 17-23 Wochen, adult: 35-45 Wochen, alt: 60-80 Wochen) und dreier Genotypen (gesunder Wildtyp – wt; heterozygot für die Mutation – HET und homozygot – HOM) entnommen. Zusätzlich wurden drei Muskeln als Vertreter langer Beinmuskeln (soleus – SOL, extensor digitorum longus – EDL) und kurzer Zehenmuskeln (interossei) untersucht, wobei EDL ein vorrangig schneller Muskel und SOL ein nicht-ermüdbarer langsamer Haltemuskel darstellt. Second Harmonic Generation (SHG) Mikroskopie und Kern-Fluoreszenz-Darstellungen, gefolgt von quantitativer Morphometrie (Strukturabbildung bzgl. Kosinuswinkelsummen – CAS, Vernierdichten - VD) lieferten folgende wesentlich neue Erkenntnisse zum Fortgang und zur Ausprägung des Krankheitsbildes: (i) im Altersverlauf zeigten alle drei Genotypen, auch der wt, eine Zunahme der strukturellen Unordnung der kontraktilen Muskelfilamente (Myofibrillen), als Hinweis einer alterskorrelierten Abnahme der Kraft. (ii) im DesR349P Hintergrund zeigte sich eine deutlich stärkere Beeinträchtigung der Myofibrillen-Geometrie, welche mit der Anzahl der mutierten Allele korrelierte (HOM > HET). Dies deutet auf eine deutlich strukturell-bedingte Einbuße der Kraftentwicklung im desminopathischen Mutationshintergrund hin. (iii) zusätzlich zur myofibrillären Unordnung zeigten R349P Muskelfasern eine deutliche nukleäre Pathologie durch abgerundete und voluminösere Kerne (HOM > HET). (iv) im R349P Hintergrund zeigte sich eine frühzeitige Fibrosierung des Muskelgewebes. Eine wesentliche Neuerung im Bereich der optischen Bildgebung mittels SHG Morphometrie zeigte sich im zweiten Bereich des Projektes, in welchem ein neues, miniaturisiertes Biomechatronik-System zur simultanen Erhebung der von Muskelfasern ausgeübten Kraft und der myofibrillären Geometrie entworfen und gebaut wurde. In der Vergangenheit konnte bisher nur über die Auswirkungen myofibrillärer Unordnung auf die Kraftentwicklung spekuliert werden, da keine direkte Korrelation möglich war. Mit unserem neuen MechaMorph System konnten daher zum ersten Male SHG Messungen bei graduierter Ca2+-Aktivierung von Muskelfasern mit Messung der aktiven isometrischen Kraft verbunden werden. Zusätzlich wurden auch passiv-elastische Eigenschaften mit optischer Morphometrie korreliert. Als Modell-Systeme wurden hier wt-Fasern und Fasern von EDL Muskeln adulter dystropher mdx Mäuse verwendet, um einen großen Bereich myofibrillärer Strukturausprägung abbilden zu können (Anmerkung: mdx-Fasern zeigen ultrastrukturelle Unordnung, wie sie weder in wt- Fasern noch in DesR349P-Fasern so ausgeprägt zu finden ist). Hier konnten wir an vielen Einzelmessungen eine lineare Korrelation zwischen struktureller Ordnung und maximaler Kraftentfaltung erstmals experimentell quantitativ nachweisen. Dies erlaubte eine exakte Zuordnung zur prädiktiven Kraftentwicklung ausgehend von allein optischer Vermessung der Ultrastruktur. Insbesondere der letzte Aspekt sollte künftig weiter ausgebaut und in eine digitale Pathologie-Plattform überführt werden, um aus humanen Muskelbiopsien neben dünnen histologischen Untersuchungen mittels H&E Färbung, wie ansonsten bisher üblich, zusätzlich nicht-lineare SHG Mikroskopie in 3D und quantitative Morphometrie anzuschließen. Hierdurch würde erstmalig die Myopathie-Diagnostik im Bereich Diagnose, Therapie- Beurteilung oder Progredienz-Dokumentation um eine optisch basierte Prädiktion der isometrischen Muskelkraft erweitert werden können.
Publications
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