4D-Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop für in vivo time lapse imaging, PK, FRAP und TIRF
Final Report Abstract
Die genaue Kenntnis der räumlichen und zeitlichen Verteilung von Proteinen und Nukleinsäuren erlaubt es, Aussagen über Funktion und Dynamik von Zellen zu machen. In den letzten Jahren wurden immer bessere optische Methoden entwickelt, um die Auflösung sowohl in räumlicher, wie zeitlicher Hinsicht zu verbessern. Parallel dazu sind eine Vielzahl von neuen Fluorophoren entwickelt und beschrieben worden, die verbesserte Eigenschaften haben. Neben deutlich erhöhten Photonenausbeuten, verbesserter Stabilität und geringerer Reifungsdauer, sind auch Fluorophore entwickelt worden, die durch gezielte Lasermanipulation ihre Fluoreszenzeigenschaften ändern. So werden zum Beispiel photo-konvertierbare Fluorophore eingesetzt, die für die Bestimmung von Proteindynamik und Lebensdauer eingesetzt werden. Die Dynamik von Proteinen in der Zelle kann auch durch das sogenannte „Fluorescence recovery after Photobleaching“ kurz FRAP analysiert werden. Die zeitliche Verfolgung der Proteindynamik erfolgt dabei in Zeitreihenaufnahmen. Eine technische Herausforderung ist hierbei, dass der Fokus über einen langen Zeitraum exakt gehalten wird. Für Zeitreihenaufnahmen mit wachsenden Zellen werden heute zumeist sogenannte Mikrofluidik-Kammern genutzt, bei denen Nährmedium konstant zugeführt werden kann und die Zellen in einer mikroskopisch kleinen Kammer wachsen, die auf dem Kreuztisch des Mikroskops fixiert ist. Mit dieser Technik lassen sich Wachstum und Proteindynamik unter verschiedenen Bedingungen (Einfluss von Stress, Nahrungszustand etc.) untersuchen. Das 4D-Weitfeldfluoreszenz-Mikroskop mit drei Laserlinien (405 nm, 488 m, und 561 nm) sowie einer „solid state“ Beleuchtungseinheit ist für die oben beschriebenen Anwendungen ideal geeignet. Es zeichnet sich durch eine hohe Präzision des Kreuztisches und eine gute Justierbarkeit der Laser aus. Zudem hat es einen sehr gut funktionierenden „Hardware Autofokus“, der auch lange andauernde Zeitreihenaufnahmen ermöglicht. Das Department I der Fakultät Biologie betreibt das Gerät zusammen mit anderen Lichtmikroskopen und ermöglicht den Zugang für unterschiedliche Nutzer aus der Genetik, Mikrobiologie, Pflanzenwissenschaften und Zellbiologie. Die Fragestellungen, die mit Hilfe dieses Mikroskops bearbeitet werden, reichen von der Analyse der Zellteilung bei Bakterien, der Lokalisation von Membranrezeptoren in Bakterien und Pflanzen, der Lokalisation von Proteinen in Parasiten, der Analyse von Magnetosomen, bis zu der Aufklärung von Proteinlokalisation in Chloroplasten bzw. Thylakoiden aus Cyanobakterien. Das 4D-Weitfeldfluoreszenz-Mikroskop hat seine Stärke besonders in der Visualisierung kleiner, lichtschwacher Proben. So ist z.B. die Kopienzahl von vielen Membranrezeptoren sehr gering und mit Standardverfahren sind diese nicht aufzulösen. Ebenso, sind einige Proteine der Zellteilungsmaschinerie nun in wenigen Kopien vorhanden. Durch die gleichbleibende Beleuchtung der Probe mit Hilfe des „solid state“ Moduls können diese Proteine auch in Zeitreihenaufnahmen gut visualisiert werden. Das Gerät ist aufgrund seiner vielfältigen Einsatzmöglichkeiten und der hohen Präzision und Stabilität der Standard für alle Anwendungen im Bereich Weitfeldmikroskopie im Department geworden. Konsequenterweise ist das Großgerät derzeit zu 100 % ausgelastet.
Publications
- (2014) Interlinked sister chromosomes arise in the absence of condensin during fast replication in B. subtilis. Curr Biol. 24, 293-298
Gruber S, Veening JW, Bach J, Blettinger M, Bramkamp M, Errington J
(See online at https://doi.org/10.1016/j.cub.2013.12.049) - (2014). Plasma Membranes Are Subcompartmentalized into a Plethora of Coexisting and Diverse Microdomains in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana. The Plant Cell, Vol. 26: 1698–1711
Jarsch IK, Konrad SSA, Stratil TF, Urbanus SL, Szymanski W, Braun P, Braun KH and Ott T
(See online at https://doi.org/10.1105/tpc.114.124446) - (2015) A prophage-encoded actin-like protein required for efficient viral DNA replication in bacteria. Nucleic Acids Res. 43:5002-5016
Donovan C, Heyer A, Pfeifer E, Polen T, Wittmann A, Krämer R, Frunzke J, Bramkamp M
(See online at https://doi.org/10.1093/nar/gkv374) - (2015). Knockin' on pollen's door: live cell imaging of early polarization events in germinating Arabidopsis pollen. Frontiers in Plant Science
Vogler F, Konrad SSA, Sprunck S
(See online at https://doi.org/10.3389/fpls.2015.00246) - (2016). Genetic and ultrastructural analysis reveals the key players and initial steps of bacterial magnetosome membrane biogenesis. PLoS Genetics 12(6):e1006101
Raschdorf, O., Y. Forstner, I. Kolinko, R. Uebe, J.M. Plitzko, and D. Schüler
(See online at https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006101) - (2016). Quantitative Proteomics Uncovers Novel Factors Involved in Developmental Differentiation of Trypanosoma brucei. PLoS Pathog 12, e1005439
Dejung, M., Subota, I., Bucerius, F., Dindar, G., Freiwald, A., Engstler, M., Boshart, M., Butter, F., and Janzen, C.J.
(See online at https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005439) - (2016). Segregation of prokaryotic magnetosomes organelles is driven by treadmilling of a dynamic actin-like MamK filament. BMC Biology 14:88
Toro-Nahuelpan, M., F.D. Müller, S. Klumpp, J. Plitzko, M. Bramkamp, D. Schüler
(See online at https://doi.org/10.1186/s12915-016-0290-1) - (2016). The role of Slr0151, a tetratricopeptide repeat protein from Synechocystis sp. PCC 6803, during Photosystem II assembly and repair. Front. Plant Sci. 7: 605
Rast, A., Rengstl, B., Heinz, S., Klingl, A., and Nickelsen, J.
(See online at https://doi.org/10.3389/fpls.2016.00605) - (2016). Thylakoid membrane architecture in Synechocystis depends on CurT, a homolog of the granal Curvature Thylakoid1 proteins. Plant Cell 28: 2238-2260
Heinz, S., Rast, A., Shao, L., Gutu, A., Gügel, I.L., Heyno, E., Labs, M., Rengstl, B., Viola, S., Nowaczyk, M.M., Leister, D., and Nickelsen, J.
(See online at https://doi.org/10.1105/tpc.16.00491) - (2017) Plant immune and growth receptors share common signalling components but localise to distinct plasma membrane nanodomains eLife, e25114
Bücherl CA, Jarsch IK, Schudoma C, Segonzac C, Mbengue M, Robatzek S, MacLean D, Ott T and Zipfel C
(See online at https://doi.org/10.7554/eLife.25114)
