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Projekt
Regulation der peroxisomalen Protein-Importpore
Antragstellerinnen / Antragsteller
Dr. Harald Platta; Professorin Dr. Bettina Warscheid
Fachliche Zuordnung
Biochemie
Förderung
Förderung von 2013 bis 2021
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 219314758
Der Import peroxisomaler Matrixproteine beruht auf der dynamischen Interaktion zahlreicher Proteine und der Translokation von Proteinen durch spezielle, transiente Poren. Das zentrale Ziel in Projekt 6 ist die Identifizierung molekularer Mechanismen, die bei der Regulation einzelner Schritte dieses Prozesses eine Rolle spielen. Dabei liegt der Fokus auf posttranslationalen Modifikationen (PTMs). In der ersten Antragsphase konnten wir zeigen, dass Pex5p und Pex14p, die zentralen Komponenten der Importpore für PTS1-Matrixproteine, in vivo stark phosphoryliert vorliegen. Funktionelle Analysen ergaben, dass die Expression von phosphomimetischem Pex14p zu einem partiellen Importdefekt für PTS1-Proteine führt, und dass die Phosphorylierung des Pex5p an S232 transient während des Rezeptorzyklusses erfolgt. Ferner haben wir mehrere Kinasen identifiziert, die Pex5p und Pex14p an bestimmten Serin- und Threoninresten phosphorylieren, und gezeigt, dass die Caseinkinase 2 eine regula¬to¬rische Rolle bei der Expression ölsäureinduzierbarer peroxisomaler Gene spielt, die für die Porenbildung wichtig sind oder Matrixproteine kodieren. Funktionelle Analysen der Pex5p-Ubiquitinierung, die den Rezeptor zur Wiederverwertung (Monoubiquitinierung) oder dem proteasomalen Abbau (Polyubiquitinierung) markieren, führten zu Erkenntnissen über die Mechanismen der Mono-/Polyubiquitinierung und der ubiquitinabhängigen Regulation des Matrixproteinimports. Darüber hinaus identifizierten wir das Protein Dyn2p, das durch Pex17p rekrutiert wird, als Komponente eines Pex14p/Pex17p/Dyn2p-Komplexes. Die Etablierung eines chemischen cross-linking Ansatzes in Kombination mit hochauflösender Massenspektrometrie (XL-MS) ermöglichte zudem die Bestimmung von intermolekularen Kontaktstellen im nativen Pex14p/Pex17p/Dyn2p-Komplex. Positionsspezifisches photo-XL-MS wurde erfolgreich eingesetzt, um Kontaktstellen und die Abfolge von Bindungen in einem Pex5p-PTS1-Protein-Komplex zu identifizieren. In der kommenden Antragsphase werden wir die systematische Analyse zur funktionellen Bedeutung einzelner Pex14p- und Pex5p-Phosporylierungsstellen für die Regula-tion des peroxisomalen Matrixproteinimports fortführen und sie auf essentielle Komponenten des PTS2-Importweges in Hefe sowie auf humanes PEX14 und PEX5 ausdehnen. Für Phosphorylierungsstellen mit regulatorischer Funktion werden wir die zuständige Kinase identifizieren, was es uns ermöglichen soll, die zugehörigen zellulären Signalnetzwerke zu verstehen. Zudem werden wir das Zusammenspiel von Ubiquitinierung und Phosphorylierung in der N-terminalen Region von Schlüsselproteinen der PTS1- und PTS2-Pore und dessen Bedeutung für den peroxisomalen Matrixproteinimport untersuchen. Um strukturelle Informationen über Import(sub)komplexe zu gewinnen und PTM-abhängige regulatorische Mechanismen zu entschlüsseln, werden wir unseren XL-MS-Ansatz erweitern und innovative Technologien wir native MS und vergleichende XL-MS implementieren.
DFG-Verfahren
Forschungsgruppen
