Hochaufgelöste Strukturbestimmung eines angeregten Proteinzustandes
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Ziel des beantragen Forschungsprojektes bestand in der direkten spektroskopischen Charakterisierung eines hochenergetischen Zustandes des Enzyms Adenylatkinase (AdK). Durch das Einführen einer strategischen Punktmutation in AdK ist es gelungen, solch eine Konformation im thermodynamischen Gleichgewicht zu erhalten. Die Zugabe von einem Substratanalog zu AdK in stöchiometrischen Mengen führte zu zwei NMR- spektroskopisch unterscheidbaren substratgebundenden Konformationen. Im weiteren Projektverlauf konnte durch den komplementären Einsatz einer Vielzahl biophysikalischer Methoden, wie isothermaler Titrationskalorimetrie, Circulardichroismus, NMR- und kinetischer Fluoreszenzspektroskopie, gezeigt werden, dass die Zeitskala des Austausches zwischen diesen beiden Konformationen der Zeitskala des katalytischen Umsatzes von AdK entspricht. Die Präparation und nachfolgende Charakterisierung einer zweiten Punktmutation erlaubte es, die Energielandschaft von Adenylatkinase genauer zu charakterisieren. Ferner konnten jeweils von beiden Punktmutationen die hochaufgelösten dreidimensionalen Strukturen sowohl für den freien als auch für den substratgebundenden Zustand kristallisiert und mittels Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt werden. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die geplanten Arbeiten durchgeführt und neue Beiträge durch die eingehende Charakterisierung eines hochenergetischen Proteinzustandes für das Verständnis der Enzymkatalyse von AdK geleistet wurden. Dies stellt ein großes Potenzial für das Design von Enzymen dar, deren jeweilige Funktion auf das kontrollierte Abstimmen der inhärenten Konformationsdynamik eines Enzyms basiert. Des weiteren konnte sich der Antragsteller während der Projektbearbeitung im Rahmen dieses Forschungsstipendiums in molekularbiologische Methoden einarbeiten und dadurch einen direkten Zugang zur Präparation von isotopenmarkierten Proben für hochaufgelöste NMR-spektroskopische Experimente erlangen. Dies stellt eine erfolgsversprechende Basis für künftige, auch interdisziplinäre, Forschungsprojekte im Feld der NMR-Spektroskopie dar.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Structural basis for catalytically restrictive dynamics of a high-energy enzyme state (2015). Nat. Commun., 6:7644
Kovermann M, Ådén J, Grundström C, Elisabeth Sauer- Eriksson A, Sauer UH, Wolf-Watz M
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/ncomms8644) - Protein dynamics and function from solution state NMR spectroscopy. Q. Rev. Biophys., Volume 49, 2016 , e6
Kovermann M, Rogne P, Wolf-Watz M
(Siehe online unter https://doi.org/10.1017/S0033583516000019) - The C-terminus of human copper importer, Ctr1, acts as binding site and transfers copper to Atox1 (2016). Biophysical J., 110:1-8
Kahra D, Kovermann M, Wittung-Stafshede P
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.bpj.2015.11.016)
