Effekt der Kombination von Nanostrukturierung und Polyelektrolytmultischichten auf die Differenzierung von Stammzellen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Mesenchymale Stammzellen aus Fettgewebe(hADSC) haben die Fähigkeit in verschiedene Gewebetypen wie Knochen, Knorpel, Fett- und Bindegewebe zu differenzieren und stellen deshalb eine interessante Quelle für die Regeneration von Geweben im Bereich des Tissue Engineerings dar. Es ist zudem bekannt, dass die Größe und Form dieser Zellen bei Kontakt mit Biomaterialien einen entscheidenden Einfluss auf deren Differenzierung haben kann, wobei beispielsweise stark ausgebreitet Zellen in Knochen und abgerundet Zellen eher in Knorpel oder Fettgewebe differenzieren können. Einfluss auf die Form von Zellen haben physikalische Eigenschaften von Implantatmaterialien, wie z.B. eine Nano- und Mikrostrukturierung aber auch die mechanischen Eigenschaften des Substrates (weiche oder härtere Unterlage). Diese Effekte gehen einher mit Änderungen der Kontaktareale der Zellen, sogenannten fokalen Adhäsionen, der Übertragung von Signalen durch verschiedene Kinasen und GTPasen in den Zellen (z.B. FAK und RhoA) und der Struktur sowie mechanischen Spannung des Zellskeletts. Ausgehend von diesen Kenntnissen bestand die Zielstellung des Vorhabens darin durch eine Kombination von nanostrukturierten Oberflächen mit einem darauf assemblierten viskoelastischem Element aus Polyelektrolyt-Multischichten (PEM), durch Änderungen der Abstände und mechanischen Eigenschaften der PEM die Ausbreitung von hADSC und nachfolgend deren Differenzierung zu beeinflussen. Die Nanostrukturen wurden zunächst mit der Nanosphärenlithographie (NSL) und im weiteren Verlauf mit der Laserinterferenzlithographie (LIL) erzeugt, wobei ein zweiphasiges System aus Silizium und Gold entstand. Es konnte weiter gezeigt werden, dass sich die das umliegende Silizium durch die Passivierung mit einem langkettigem Polyethylenglykol-Organosilan gezielt passivieren lässt, während das Gold mit einem Thiol mit endständiger Karboxylgruppe eine negative Oberflächenladung erhielt, wodurch eine exklusive Interaktion der Zellen mit den Goldstrukturen gewährleistet wurde. Erste Versuche die mit humanen Fibroblasten zeigten eine Zunahme der Größe von Zellen mit abnehmenden Abständen und Größen der Strukturen, was sich fördernd auf das Wachstum der Zellen auswirkte. Versuche mit hADSC auf mit LIL erzeugten Nanostrukturen konnten diese Ergebnisse reproduzieren, wobei sich auch Hinweise auf einen Einfluss auf die Zelldifferenzierung mit einer erhöhten chondrogene Differenzierung auf den kleineren Strukturen ergaben. In weiteren Untersuchungen wurde zunächst ein PEM aus Poly-L-Lysin und Hyaluronsäure auf unstrukturierten Materialoberflächen etabliert, dessen Elastizität durch chemisches Vernetzen eingestellt wurde. Hier zeigte sich ein starker Einfluss der mechanischen Eigenschaften, da hADSC auf den unvernetzten weichen PEM abgerundet bleiben und adipogen differenzierten, während auf hochvernetzten, festeren PEM eine stärkere Ausbreitung erfolgte, die ein osteogene Differenzierung förderte. Schließlich wurden die mittels LIL erzeugten Nanostrukturen mit diesem PEM kombiniert. Hier zeigten sich größere Abhängigkeiten des Zellverhaltens vom Vernetzungsgrad als von den Strukturdimensionen und -abständen. Interessanterweise nahm die Intensität von RhoA und fokaler Adhäsionskinase (FAK) mit zunehmendem Vernetzungsgrad gerade auf den kleinen Strukturen zu, wobei überraschenderweise eine Abnahme der Zellgröße mit dem Vernetzungsgrad beobachtet wurde, was dem Verhalten auf homogenen PEM entgegensteht. Dabei war die Osteogenese auf den stärker vernetzten PEM und den großen Nanostrukturen erhöht, wohingegen unvernetzte PEM auf den selbigen Strukturen die Chondrogenese stärker förderten. Eine adipogene Differenzierung konnte hingegen nicht beobachtet werden. Insgesamt konnten in dem Vorhaben eine neue Methode – die Laser-Interferenz-Lithographie für die Nanostrukturierung von Biomaterialoberflächen etabliert werden und erstmals eine Kombination von Polyelektrolyt-Multischichten mit nanostrukturierten Substraten realisiert werden, die durch die chemische Vernetzung eine zusätzliche Variation der viskoelastischen Eigenschaften von Nanostrukturen ermöglichte, die auch Einfluss auf die Differenzierung mesenchymaler Stammzellen hatte. Damit neben eiben besserem Verständnis des Verhalten auch Zellen eröffnen sich auch neue Möglichkeiten für die Gestaltung der Oberflächen von Biosensoren und Implantatmaterialien für medizinische Anwendungen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Cross-linking multilayers of poly-l-lysine and hyaluronic acid: Effect on mesenchymal stem cell behavior, The International Journal of Artificial Organs, 2018, 41(4): 223-35
Niepel M.S., Almouhanna F., Ekambaram B.K., Menzel M., Heilmann A., Groth T.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1177/0391398817752598) - Nanoscaled Surface Patterns Influence Adhesion and Growth of Human Dermal Fibroblasts, Langmuir, 2013, 29 (43): 13278-90
Niepel M.S., Singh P., Fuhrmann B., Leipner H.S., Groth T.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/la402705r) - Effect of Polyelectrolyte Multilayers Assembled on Ordered Nanostructures on Adhesion of Human Fibroblasts, ACS Applied Materials & Interfaces, 2016, 8(38): 25142-51
Niepel M.S., Mano J.F., Groth T.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/acsami.6b09349) - Introduction of laser interference lithography to make nanopatterned surfaces for fundamental studies on stem cell response, ACS Biomaterials Science & Engineering, 2018; 4:1820-1834
Ekambaram B.K., Niepel M.S., Fuhrmann B., Schmidt G., Groth T.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/acsbiomaterials.8b00060) - Polyelectrolyte Multilayers of Poly (L-lysine) and Hyaluronic Acid on Nanostructured Surfaces Affect Stem Cell Response, RCS Nanoscale 2018
Niepel M.S., Ekambaram B.K., Groth T
(Siehe online unter https://doi.org/10.1039/c8nr05529g) - Stimuli-Responsive Multilayers Based on Thiolated Polysaccharides That Affect Fibroblast Cell Adhesion, ACS Appl. Mater. Interfaces, 2018; 10(10): 8507-8518
Esmaeilzadeh P., Köwitsch A., Liedmann A., Menzel M., Fuhrmann B., Schmidt G., Klehm J., Groth T.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/acsami.7b19022)
