Signalmoleküle bei der Regulation des Ionentransports an einem sekretorischen Epithel durch intrazelluläres Ca2+

• Applicant: Professor Dr. Martin Diener
• Subject Area: Veterinary Medical Science
• Term: from 2006 to 2010
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 23140063

Ein Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration löst am Kolonepithel eine massive Ionensekretion aus. Hierbei spielen intrazelluläre Ca2+-Kanäle, die die Freisetzung von Ca2+ aus Speicherorganellen vermitteln, eine wichtige Rolle. Ca2+-abhängige Sekretagoga stimulieren - initial vermittelt über Inositol-1,4,5-Trisphosphat (IP3)-Rezeptoren (IP3R)- eine Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern, was durch eine Ca2+-induzierte Ca2+- Freisetzung über Ryanodinrezeptoren (Ryr) verstärkt wird. Am Kolonepithel der Ratte besteht ein deutlicher Gradient hinsichtlich der Verteilung von verschiedenen Subtypen von IP3R: der Subtyp IP3R2 ist im Zellkern lokalisiert und wird gleichmäßig von Krypten- wie von Oberflächenzellen exprimiert, während der IP3R3 sich im Zytoplasma lediglich von Oberflächenzellen findet. Die physiologische Bedeutung dieses IP3R3-Gradienten ist völlig unbekannt. Daher sollen an isolierten, mit Fura-2 aufgeladenen Krypten Ca2+-Wellen, die durch Carbachol bzw. direkt durch IP3 ausgelöst werden, im Bereich verschiedener Abschnitte der Krypte untersucht werden. Funktionelle Unterschiede in der sekretorischen Antwort werden durch Aufladen der Krypten mit dem Halid-sensitiven Farbstoff MEQ erfasst, um zu messen, ob die Ca2+-abhängige Cl--Sekretion Unterschiede entlang der Kryptenachse aufweist. Zur definitiven Identifizierung des Zellkerns als Ca2+-Speicher soll die Änderung der nukleären Ca2+-Konzentration nach Aufladung mit Fluo-5N in einem konfokalen Mikroskop untersucht werden. Außerdem soll geklärt werden, ob es neben IP3R2 auch Ryrs im Zellkern gibt. Dazu wird getestet, ob Ryanodin eine Ca2+-Freisetzung aus isolierten Epithelzellkernen auslösen kann. Dies wird durch immunhistochemische Untersuchungen auf licht- und elektronenoptischer Ebene zur Lokalisation von Ryrs ergänzt. Zur Klärung der Frage, wie die Befüllung der nukleären Speicher mit Ca2+ erfolgt, soll zuerst anhand von RT-PCR Experimenten geklärt werden, welche Isoformen von sarko/endoplasmatische Retikulum Ca2+-ATPase (SERCA) bzw. SPCAs (secretory-pathway Ca2+-ATPases) im Kolonepithel exprimiert werden und anschließend die entsprechenden Isoformen immunhistochemisch lokalisiert werden. Außerdem soll die Signalkette, die an der Aktivierung von Ca2+-abhängigen apikalen Cl--Kanälen beteiligt ist, untersucht werden. Vorversuche weisen auf eine zentrale Rolle von NO-Synthasen (NOS) und des Zytoskeletts. In Ussingkammerversuchen wird durch Zugabe von Inhibitoren getestet, welche Form der NO-Synthase an der Signalkaskade beteiligt ist und welche Pharmaka, die Aktin bzw. Tubulin modifizieren, die Signalkette vom Muscarinrezeptor zum apikalen Cl--Kanal unterdrücken. Das erhoffte Ziel dieser Untersuchungen ist es, zum Verständnis der Regulation des intestinalen Elektrolyttransportes und der Induktion von sekretorischen Diarrhoen beizutragen.

• DFG Programme: Research Grants