Hammerhead Ribozyme: Funktionsanalyse pflanzlicher Motive und Etablierung einer Internet-basierten Datenbank

• Antragsteller: Professor Dr. Christian Hammann
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2012 bis 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 224918619

Das Hammerhead Ribozyme (HHRz) ist ein kleines katalytisches RNA Motiv mit sequenz-spezifischer Spaltungs- und Ligationsaktivität, die von zweiwertigen Metallionen abhängt. Im Jahr 2005 haben wir HHRz Motive in A. thaliana, als erstem Pflanzengenom, identifiziert, und Expression und Spaltungsaktivität in verschiedenen Geweben gezeigt. Seither konnten wir zeigen, dass diese Motive in verschiedenen anderen Pflanzen konserviert sind (und dass HHRz Motive in einer sehr großen Anzahl von Genomen vorhanden sind).Neben der Etablierung einer Internet-basierten Datenbank der HHRz Motive werden wir in diesem Projekt die pflanzlichen HHRz Sequenzen detailliert biochemisch und funktionell untersuchen. So werden die HHRzs auf ihre Gewebe-Spezifität und sub-zelluläre Lokalisation untersucht und primäre und prozessierte Transkripte kloniert. Dies soll funktionell mit der Expression möglicher mRNA Zielsequenzen korreliert werden, die in antisense Orientierung zu den HHRz liegen. Da die Expression der HHRz RNAs durch Licht beeinflusst wird und partiell mit der der mRNAs überlappt, werden wir mittels in situ Hybridisierungen untersuchen, ob die entsprechenden mRNAs co-lokalisieren. Funktionelle Analysen in vivo beinhalten die Untersuchung von homozygoten T-DNA Insertionslinien, die wir herstellen werden. Entsprechende Linien sollen weiter mittels siRNAs und ektopischer RNA Expression untersucht werden.Nach der überraschenden Entdeckung eines geteilten HHRz, soll untersucht werden, ob andere als die vorgenannten mRNAs zelluläre Zielsequenzen der HHRz darstellen, die diese RNAs in trans spalten würden. Dazu werden wir T-DNA Insertionslinien und solche, in denen wir die HHRz Motive ektopisch überexprimieren, auf globale Veränderungen im Expressionsmuster mittels deep sequencing untersuchen. Diese Daten werden mit den Wildtyp-Mustern verglichen um potentielle Zielsequenzen der HHRz zu identifizieren. Dies wiederum wird mit bioinformatischen Analysen korreliert, in denen Ziel-RNAs de novo vorhergesagt werden sollen. Mit den voran genannten Methoden sollen diese Sequenzen auf ihr zeitliches und räumliches Expressionsmuster untersucht und mit dem der HHRz verglichen werden.Die ungeheuer große Anzahl an HHRz Sequenzen, die wir und andere Gruppen in den vergangenen Jahren entdeckt haben, machen eine Internet-basierte Datenquelle unabdingbar. Dazu werden wir die “Hammerhead Ribozyme Database” etablieren und pflegen. Darin sollen nicht nur alle Motive nach Organismus aufgeführt, sondern vielmehr alle erhältlichen Informationen zu genomischer Lokalisation, Struktur, Expression, biologischer Funktion, usw. zusammengetragen werden. Nach der Etablierung der Datenbank im Rahmen dieses Antrags soll die MySQL-Datenbank weiter von einem Mitglieder meiner Gruppe gepflegt werden, um die Daten langfristig zu sichern und zugänglich zu machen. Die anderen drei Gruppen, die ähnliche Suchen nach HHRz durchgeführt haben, haben vollen Zugang zu ihren Sequenzen und Daten zugesagt.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen