Konfokales Lasersanning-Mikroskop für Live Cell Imaging (Gerät der Technologieplattform Lichtmikroskopie)
Final Report Abstract
Die Arbeitsgruppe Fischer von Mollard nutzt das konfokale Laser Scanning Mikroskop (LSM) zur Analyse von Membrantransport innerhalb von Säugerzellen. Vesikel werden vom Ursprungsorganell abgeschnürt und verschmelzen durch Bildung von Komplexen aus SNARE-Proteinen mit der Zielmembran. Es wurden knock-out Mäuse generiert, denen die endosomalen SNAREs Vti1a oder Vti1b fehlen. Doppeldefiziente Mäuse sterben bei der Geburt wegen Defekten im Nervensystem wie dem Absterben von Neuronen und dem Fehlen von Nervenfasern. Aus diesen Mäusen wurden Zellen wie Fibroblasten, Neuronen und Makrophagen isoliert und in Kultur genommen. Mittels LSM wurde die Verteilung von unterschiedlichen Proteinen und die Morphologie der Organellen durch Colokalisationen von Fusionsproteinen mit fluoreszierenden Proteinen oder Immunofluoreszenzen untersucht. Außerdem wurden die Endocytose und der Transport zum Lysosom in Zellen verschiedener Genotypen verglichen. In Makrophagen wurden die Phagocytose von fluoreszierenden Bakterien sowie die Phagosomenreifung analysiert. In Neuronen wurde die Bildung von Neuriten und Synapsen verfolgt. Ein weiteres Projekt beschäftigt sich mit der Regulation des ER-Golgi-Transports durch SNARE-Proteine. Durch Einsatz des LSM wird die subzelluläre Lokalisation von SNAREs und seinen Interaktionspartnern einzeln und abhängig voneinander aufgeklärt. Weiterhin wird die Regulation des ER-Golgi Transports durch SNAREs und ihre Interaktionspartner durch gezielten Einsatz modifizierter Reporterproteine analysiert. Hierbei werden humane und murine Zelllinien, sowie primäre hippocampale Neuronen verwendet. Die Arbeitsgruppe Dierks und die assoziierte Arbeitsgruppe Lübke nutzen das LSM zur Analyse lysosomaler Proteine, insbesondere der neu-identifizierten Sulfatasen ARSG und ARSK, der Glykosidase α- L-Fucosidase und der putativen Hydrolasen PLBD1 und PLBD2, in Säugerzellen. Ferner wird das LSM zur Analyse von Gewebeschnitten von Mausmodellen mit lysosomalen Speichererkrankungen hinsichtlich (neuro)pathologischer Veränderungen wie dem Vorkommen von Speichervakuolen in verschiedenen Geweben, insbesondere im zentralen Nervensystem, aber auch in viszeralen Organen wie Leber, Niere, Milz und Pankreas, verwendet. Hinsichtlich der Neuropathologie stehen auch Veränderungen wie Myelinisierungsdefekte und entzündliche Prozesse wie Astrogliose und der Verlust von spezifischen Zellpopulationen (z.B. Purkinje-Zellen des Kleinhirns) im Mittelpunkt des Interesses. Die Arbeitsgruppe Dierks erforscht zudem neu beschriebene nicht-lysosomale Sulfatasen, für die knockout Mausmodelle generiert wurden. Hier stehen insbesondere die an der Zelloberfläche lokalisierten Sulf1 und Sulf2 sowie deren dynamische Interaktion mit Proteoglykanen im Fokus der Arbeiten. Ein weiterer Schwerpunkt unter Einsatz des LSM ist die Erforschung des Formylglycin-generierenden Enzyms FGE und seiner vielfältigen Interaktionspartner im endoplasmatischen Retikulum sowie im Golgi-Apparat. Auch das Verständnis der Sekretion und der zuvor beschriebenen Retrotranslokation von FGE sind aus Sicht der Grundlagenforschung, aber auch als therapeutische Option bei Multipler Sulfatasedefizienz von vorrangigem Interesse. Die Arbeitsgruppe Sewald nutzt das LSM für die Evaluierung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten. In Kooperation mit den Arbeitsgruppen Müller und Dierks werden Antikörper-Fragmente hergestellt, die gegen den EGF-Rezeptor gerichtet sind. Für Untersuchungen, ob diese Konstrukte internalisiert werden und in welchem Kompartimenten der Zelle eine Anreicherung stattfindet, werden die Antikörper-Fragmente mit einem Fluorophor über den FGly-tag konjugiert. Durch Live Cell Imaging wird die Bindung an EGFR auf der Zelloberfläche, die Internalisierung und die Akkumulation in den Lysosomen verfolgt. Für diese Experimente werden verschiedene Krebzselllinien eingesetzt, um Selektivitätsprofile zu erhalten.
Publications
- (2016) A mouse model for fucosidosis recapitulates storage pathology and neurological features of the milder form of the human disease. Dis Model Mech. 2016 Sep 1; 9(9):1015-28
Wolf H, Damme M, Stroobants S, D'Hooge R, Beck HC, Hermans- Borgmeyer I, Lüllmann-Rauch R, Dierks T, Lübke T
(See online at https://doi.org/10.1242/dmm.025122) - (2017) Expanding the genetic cause of Multiple Sulfatase Deficiency: A novel SUMF1 variant in a patient displaying a severe late infantile form of the disease. Mol. Genet. Metab. 121, 252-258
Jaszczuk, I., Schlotawa, L., Dierks, T., Ohlenbusch, A., Koppenhöfer, D., Babicz, M., Lejman, M. Radhakrishnan, K. & Ługowska, A.
(See online at https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2017.05.013)
