Functional reconstitution of thylakoidal Tat translocase (Twin arginine translocase) into lipid membranes
Final Report Abstract
Ziel dieses Projektes war und ist es, die thylakoidäre Tat-Transportmaschinerie, die sich aus den drei integralen Untereinheiten TatA, TatB und TatC zusammensetzt und Proteine in gefalteter Form über die Thylakoidmembran transportieren kann, in funktioneller Form in Liposomen zu rekonstituieren. Dazu wurden zunächst zwei komplementierende Ansätze verfolgt. Zum einen wurden die Tat- Untereinheiten aus den Modellpflanzen Erbse und Arabidopsis thaliana durch semi-quantitative in vitro-Synthese im eukaryotischen RTS-System in Gegenwart von Liposomen hergestellt, um so eine "co-translationelle" Membranintegration und Assemblierung in heteromere Proteinkomplexe zu ermöglichen. Zum anderen wurden diese Tat-Untereinheiten durch heterologe Überexpression in E. coli und anschließende proteinbiochemische Reinigung gewonnen. In diesem Fall sollte die Membranintegration im Anschluss an die Reinigung durch Inkubation mit Liposomen erfolgen, wobei eine Reihe unterschiedlicher Versuchsbedingungen (u.a. direkte Inkubation mit Liposomen, Destabilisierung von Liposomen durch Detergenzien, Dialyse in Gegenwart von Lipiden und Detergenzien) zum Einsatz kamen. Tatsächlich war es mit beiden Ansätzen grundsätzlich möglich, TatA, TatB und in einigen Fällen auch TatC in die Membranen zu integrieren und in Western-Analysen nachzuweisen. Allerdings lagen sie dort meist nur in monomerer Form vor. Und selbst in den Fällen, in denen nach Optimierung der Versuchsansätze höhermolekulare Proteinstrukturen in den Membranen nachgewiesen werden konnten, handelte es sich immer nur um homooligomere Proteinaggregate oder -komplexe. Vor allem TatC zeigte eine starke Tendenz zur Homo-Oligomerisierung. Zusammen mit anderen Ergebnissen führte dies zu der Vermutung, dass es sich hierbei um möglicherweise strukturell und/oder funktionell bedeutsame TatC-Core-Komplexe handeln könnte. Allerdings gab es in keinem Fall einen Hinweis auf die Bildung der für Thylakoidmembranen typischen TatBC-Oligomere. Diese Ergebnisse sowie personelle Veränderungen in der Gruppe führten zu einer teilweisen Neuausrichtung des Projektes dahingehend, dass stattdessen versucht werden sollte, die TatBC-Rezeptorkomplexe, die eine Größe von etwa 600 kDa haben, in möglichst "intakter" Form aus Thlakoidmembranen zu präparieren. Tatsächlich gelang es, durch die Kombination von Solubilisierung mit geeigneten Detergenzien und präparativen nativen Proteingelen solche Rezeptorkomplexe zu gewinnen. Wurde diese Aufarbeitung mit Thylakoiden durchgeführt, die vorher mit Substratanaloga (Hexahistidin-tag-modifizierte Transitpeptide) "beladen" worden waren, so war es sogar möglich, nach Solubilisierung und Nickel-Affinitätschromatographie die TatBC-Komplexe soweit anzureichern, dass bereits erste funktionelle Analysen durchgeführt und auch die Versuche zu ihrer Rekonstitution in Lipidvesikel wieder aufgenommen werden konnten.
