Untersuchung gewebe-spezifischer Zellfunktionen cornealer Zelltypen durch Modifikation der extrazellulären Umgebung: Ein Beitrag zur prospektiven Entwicklung von bioaktiv-biomimetischen Biomatrizes in der Augenheilkunde
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Vor dem Hintergrund der heutzutage immer noch bestehenden Erfordernis zur Entwicklung neuer Biomaterialien im Kontext der Regeneration der Augenoberfläche, stand neben der Identifikation und Testung der Eignung eines möglichen Kandidaten-Biomaterials die Modulation des Zellverhaltens von Zellen der humanen Cornea im Antragsfokus. Dies deshalb, da Biomaterialien, ähnlich der nativen extrazellulären Umgebung durch biomechanische Parameter charakterisiert sind, nämlich Adhäsionsstrukturen in zellkompatiblen Abstandsbereichen und eine Steifigkeit/E-Modul, die das Zellverhalten, wie zum Beispiel die Proliferation und/oder Differenzierung/Reifung beeinflusst. Um die biomechanische Zellresponsivität möglichst gewebenah testen zu können, sind geweberelevante Zellsysteme von großem Nutzen. Aus diesem Grunde haben wir im Gegensatz zu bisher publizierten Zellsystemen ein holistisches uniform immortalisiertes Zellsystem der humanen Cornea etabliert, in dem alle drei Zelltypen, die Cornea-epithelialen Keratinozyten (CEK), die -Fibroblasten (CF) und die -Endothelzellen (CE) mit nur einem Agens, den HPV-16 Genen E6 und E7 immortalisiert wurden. Dieses fortschrittliche Vorgehen schließt Expressionsunterschiede gewebe-authentischer Biomarker durch unterschiedliche Immortalisierungsagenzien aus und hat zu Zelllinien aller drei cornealen Gewebe geführt, die auf Grund ihres Biomarkerprofils als gewebeauthentisch einzustufen sind. Dies galt nicht nur für die Zelllinien als solitäre Kulturen, sondern auch für ein in vitro generiertes corneales Gewebeäquivalent, das aus der interaktiven Kokultur aller drei Zelltypen generiert werden konnte. Anwendungsbereiche für ein solches in vitro Gewebeäquivalent sind neben der prospektiven Testung der Eignung von Kandidaten-Biomaterialien auch die Testung der Wirkung pharmakologischer Substanzen oder Generika in der Augenheilkunde. Weiterhin konnten wir im Projektverlauf zeigen, dass hinsichtlich des Zellverhaltens die Differenzierung von CEK deutlich über die Biomechanik und hier insbesondere die Steifigkeit der extrazellulären Umgebungssubstrate moduliert wird. Da die Substratsteifigkeit Integrinvermittelt die intrazelluläre Mechanotransduktion induziert und zwischen Integrinen und Wachstumsfaktor-Rezeptoren eine Wechselbeziehung besteht, haben wir im Projekt analysiert, welche Zugabe der Wachstumsfaktor EGF als putative biomimetische Biomaterialkomponente auf integrin-basierte Fokalkontakte (Fas) und deren Mechano-Signalling hat. Hier konnten wir bei gleichbleibendem biomechanischem E-Modul der extrazellulären Umgebung zeigen, dass EGF die Aktivität von Molekülen des Fokalkontaktvermittelten Mechano-Signallings moduliert und darüber hinaus zu einer deutlichen Redistribution von Fokalkontaktkomponenten wie Integrinen in Fas führt. Bei der Wahl von Polyethylenglykol (PEG) als Kandidaten-Biomaterial im Kontext Cornea hat die Inklusion von bioaktiven Integrin-erkennenden RGD-Peptiden zu einer deutlichen Effizienzsteigerung der Zelladhäsion geführt. Darüber hinaus hat die Testung der zellkompatiblen Eigenschaften unter in vitro Bedingungen gezeigt, dass im Vergleich zur in vivo Analyse im Pilot-Tierversuch der für die Hydrogelkomponenten-Quervernetzung erforderliche Crosslinker Coumermycin und das zur gerichteten Hydrogelauflösung eingesetzte Agens, Novobiocin, nicht als unbedenklich eingestuft werden konnten. Die im Projekt gewonnenen Erkenntnisse, insbesondere zur Modulation des Zellverhaltens durch die Biomechanik und der Wechselbeziehung zwischen Integrin-vermittelter Mechanotransduktion und der Aktivität von Wachstumsfaktor-Rezeptoren, sollen unter Verwendung des holistischen Cornea-Zellsystems in weitere Arbeiten zu den molekularen Grundlagen der biomechanisch regulierten Durotaxis einfließen, da es Evidenzen gibt, dass diese eine tragende Rolle bei der Cornea-Gewebshomöostase zu spielen scheint.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Generation and evaluation of a human corneal model cell system for ophthalmologic issues using the HPV16 E6/E7 oncogenes as uniform immortalization platform. Differentiation, 2013. 85(4-5): p. 161-72
Schulz, S., et al.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.diff.2013.06.001) - Substrate elasticity as biomechanical modulator of tissue homeostatic parameters in corneal keratinocytes. Exp Cell Res, 2013. 319(12): p. 1889-901
Moers, K., et al.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2013.05.002) - Nanoindentation Derived Mechanical Properties of the Corneascleral Rim of the Human Eye. Biophysical Journal, 2014. 106(2): p. 789a
Eberwein, P., et al.
(Siehe online unter https://doi.org/10.4028/www.scientific.net/KEM.606.117) - Natural corneal cell-based microenvironment as prerequisite for balanced 3D corneal epithelial morphogenesis: a promising animal experiment-abandoning tool in ophthalmology. Tissue Eng Part C Methods, 2014. 20(4): p. 297-307
(Siehe online unter https://doi.org/10.1089/ten.tec.2013.0195) - Concise reviews: the role of biomechanics in the limbal stem cell niche: new insights for our understanding of this structure. Stem Cells, 2015. 33(3): p. 916-24
Eberwein, P. and T. Reinhard
(Siehe online unter https://doi.org/10.1002/stem.1886) - In vitro and in vivo biocompatibility evaluation of a novobiocin stimulusresponsive poly (ethylene glycol)-based hydrogel designed for soft tissue regeneration. Journal of Bioactive and Compatible Polymers: Biomedical Applications, 2015
Laird, D., et al.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1177/0883911515570370) - Modulation of focal adhesion constituents and their down-stream events by EGF: On the cross-talk of integrins and growth factor receptors. Biochim Biophys Acta, 2015. 1853(10 Pt A): p. 2183-98
Eberwein, P., et al.,
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2015.06.004)
