Regulation der Holoenzym-Dynamik von Proteinphosphatase-1 durch p97-vermittelte strukturelle Remodellierung

• Antragsteller: Professor Dr. Hemmo Meyer
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2012
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 215186895

Proteinphosphatase-1 (PP1) dephosphoryliert ein breites Spektrum von Substraten in einer Vielzahl von zellulären Prozessen. Diese funktionelle Diversität beruht auf der Bildung von alternativen PP1-Holoenzymen mit unterschiedlichen Untereinheiten. Wir hatten gezeigt, dass neu-synthetisiertes PP1 zunächst die inhibitorischen Untereinheiten SDS22 und Inhibitor-3 (I3) bindet und somit in einem inaktiven Komplex gehalten wird. Der SDS22-PP1-I3 (SPI) Komplex muss wiederum durch die hexamere AAA-ATPase p97 auseinandergenommen werden, damit PP1 anschließend mit aktivierenden Untereinheiten interagieren kann. Im Unterschied zu p97-vermittelten degradativen Prozesse ist die Trennung des SPI-Komplexes unabhängig von Ubiquitylierung. Unsere neuesten biochemische und strukturellen Daten zeigen nun, dass eine Klasse von SEP-Domän-Adaptern das Laden des SPI-Komplexes auf p97 in einer multivalenten Weise vermittelt. Dies schließt die Bindung von Bereichen des Adapters an PP1 und I3, aber auch eine direkte Interaktion von SDS22 und der p97 N-Domäne, ein. Eine interne Erkennungsstelle in I3 wird anschließend als Peptidschleife in den zentralen Kanal von p97 inseriert. Durchfädeln des I3-Peptids löst dann I3 von PP1 und trennt den gesamten SPI-Komplex. Nachdem wir die Funktionsweise von p97 in der Trennung des SPI-Komplexes aufgeklärt haben, müssen wir nun verstehen wie SDS22 and I3 in der Regulation von PP1 kooperieren und wie ihre reversible Bindung an PP1 die Zusammensetzung der PP1-Holoenzyme auf unterschiedliche zelluläre Zustände und Stressen anpasst. Im Einzelnen möchten wir den Übergang von PP1 aus einem inaktiven SPI-Komplex zu einem spezifischen PP1-Holoenzym während der Integrierten Stressantwort (IRS) biochemisch rekapitulieren und molekular verstehen. Zu diesem Zweck werden wir komplexe biochemische Rekonstitution, verfeinerte Ansätze von Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) sowie Kristallographie verwenden und die gewonnenen Erkenntnisse in Zellen validieren. Überraschenderweise haben unsere neuen Daten auch gezeigt, dass der abundanteste SEP-Domän-Adapter, p47, gegenüber dem SPI-Komplex zumindest in vitro inaktiv ist. Wir möchten nun eine Reihe von hochentwickelten massenspektrometrischen Analyse- und Screeningverfahren verwenden, um eine alternative Verbindung zu PP1 und neue Substrate von p97-p47 aufzudecken. Hierbei werden wir die für p47 spezifischen Eigenschaften, Ubiquitin zu binden und die Aktivität von p97 zu modulieren, in unsere Ansätze einbeziehen und nutzen. Die erwarteten Ergebnisse werden aufklären, wie die Aktivität einer zentralen und vielseitigen Proteinphosphatase in komplexer Weise reguliert wird, um unterschiedliche zelluläre Prozesse und Stressantworten punktgenau zu steuern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen