Structures Illumination Microscopy (SIM) System
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das SIM Mikroskopie-System wurde innerhalb des SFB 958 Z02 Projektes geplant und von den zu dem Zeitpunkt erhältlichen SIM Systemen als das leistungsfähigste Gerät ausgewählt. Ziel war es, nanoskalige zelluläre Membrangerüststrukturen mit erhöhter Auflösung gegenüber der herkömmlichen Mikroskopie (z.B. Konfokale Mikroskopie) in mehreren Farbkanälen darzustellen. Um eine zentrale Nutzung des SIM Systems im SFB 958 und darüberhinaus zu ermöglichen, wurde das System in Absprache mit den TP-Leitern des SFB958 und der Freien Universität Berlin im Neubau CharitéCrossOver auf dem Charité Campus Mitte im Nov. 2012 installiert. Die Spezifikationen des Systems setzen eine genaue Temperaturregelung (+/- 1 Grad) vorraus, um die Präzision des Systems zu gewährleisten. Um die Wärmelast im Mikroskopieraum zu minimieren, wurde die Laser-Control-Unit deswegen im einem benachbarten Funktionsraum untergebracht, und die Verbindungsleitungen durch die Wand gelegt. Zusätzlich musste im Mikroskopieraum zur stabilen Inbetriebnahme ein 2-Wege Aircondition-System installiert werden. Desweiteren wurde empfohlen das Gerät durchgehend im Standbymodus zu fahren. D.h. es wurde zusätzlich eine UPS Unit installiert, um die Auszeiten während des monatlichen Notstromtests abzupuffern. Das beschaffte SIM System ist ein sog. ‚Early adaptor‘ System, was intensive fachliche Betreuung von Nutzern benötigt. Es basiert auf einer einzigartigen Beleuchtungs- und Detektionseinheit, die es ermöglicht, quasi-simultan 3-4 Farbkanäle gleichzeitig aufzunehmen. Allerdings gibt es auch hier physikalisch bedingte Kompromisse, so dass das System für eine zentral wichtige Wellenlänge optimiert wird, und die Nachbarwellenlängen etwas geringer aufgelöst sind. Die angegebenen Spezifikationen der optischen Auflösung wurden an Multifarben Beads demonstriert (lateral 100-120 nm, axial 250-300 nm). Nach der Aufbau- und Testphase wurde das SIM System erfolgreich für Forschungsprojekte innerhalb des SFB 958 eingesetzt. In einer Anwendung wurde mittels SIM gezeigt, dass das endozytische Adaptorprotein StnB innerhalb der neuromuskulären Synapse in nanoskaliger Nähe des Scaffoldproteins dGIT positioniert ist. In einem weiteren Projekt wurde mittels 3-Farben 3D SIM eindeutig gezeigt, dass das endozytische Adaptorprotein AP180 exklusiv prä-synaptisch und nicht post-synaptisch lokalisiert ist. In der neuromuskulären Synapse der Fliege konnte mittels SIM gezeigt werden, dass der prä-synaptische Faktor Spinophilin essentiell für die ultrastrukturelle Architektur der aktiven Zonen und für den präzisen Anreicherungslevel von postsynaptischen Rezeptoren ist. Die präzise Verteilung von akut-exozytierten synaptischen Membranproteinen innerhalb des prä-synaptischen Terminals konnte mittels 3-Farben SIM genauer untersucht werden. Zahlreiche viel versprechende Projekte innerhalb des SFB 958, aber auch mit Kollaborationspartnern in der Berliner Forschungsgemeinschaft, sind derzeit noch in Arbeit und werden in Kürze zu weiteren Publikationen führen. Laufende biologische Anwendungen beinhalten die nanoskalige Untersuchung des axonalen Zytoskeletts, der Clathrin-abhängigen Endozytosemaschinerie, der aktiven Zonen von Synapsen und von mechanosensitiven Elementen. In Zukunft wird das etablierte SIM System vielseitig innerhalb der wissenschaftlichen Projekte des SFB 958 und in Kollaboration mit anderen Institutionen zur Super-Resolution von nanoskaligen zellulären Strukturen und Dynamiken angewandt werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- A Presynaptic Role for the Cytomatrix Protein GIT in Synaptic Vesicle Recycling. Cell Rep. 7, 1–9 (2014)
Podufall J., Tian R., Knoche E., Puchkov D, Walter AM, Rosa S, Quentin C, Vukoja A, Jung N, Lampe A, Wichmann C, Böhme M, Depner H, Zhang YQ, Schmoranzer J., Sigrist S.J., Haucke V. et al.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.celrep.2014.04.051) - “Presynaptic spinophilin tunes neurexin signalling to control active zone architecture and function”, Nat Commun. 2015 Oct 16;6:8362
Muhammad K, Reddy-Alla S, Driller JH, Schreiner D, Rey U, Böhme MA, Hollmann C, Ramesh N, Depner H, Lützkendorf J, Matkovic T, Götz T, Bergeron DD, Schmoranzer J, Goettfert F, Holt M, Wahl MC, Hell SW, Scheiffele P, Walter AM, Loll B, Sigrist SJ
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/ncomms9362) - “Vesicular synaptobrevin/VAMP2 levels guarded by AP180 control efficient neurotransmission” Neuron, 2015, Oct 21;88(2):330-44
Koo SJ, Kochlamazashvili G, Rost B, Puchkov D, Gimber N, Lehmann M, Lichtner G, Zimmermann J, Salmen B, Schmoranzer J, Schmitz D, Rosenmund C, Haucke V, Maritzen T
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.neuron.2015.08.034) - ”Diffusional spread and confinement of newly exocytosed synaptic vesicle proteins”, Nature Commun., 2015 Sep 24; 6:8392
Gimber N, Tadeus G, Puchkov D, Schmoranzer J, Haucke V
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/ncomms9392)
