Durchflusszytometer
Final Report Abstract
Projekt Ina Kirmes (AG Dr. George Reid, Institut für Molekulare Biologie (IMB) gGmbH, Mainz): Ischämische Herzerkrankungen sind die häufigste Todesursache weltweit. Herzmuskelzellen detektieren ischämische Zustände und passen ihre Transkription, Translation und ihren Metabolismus diesen hypoxischen, nährstoffarmen Bedingungen an. In der vorliegenden Studie wurden die Auswirkungen einer Ischämie auf die Chromatinnanostruktur von Herzmuskelzellen untersucht und mit Veränderungen der Genexpression korreliert. Eine kurzzeitige Sauer- und Nährstoffrestriktion in der Kardiomyozytenzelllinie HL-1 induziert eine bis dato unbeschriebene Chromatinarchitektur, bestehend aus ringförmigen DNA-Atollen, verteilt zwischen großen, DNA-freien Regionen. Neben der starken Verdichtung des Chromatins, werden Histone deacetyliert und die Transkription kommt zum Erliegen. Diese Veränderungen sind reversibel; wird die Sauer- und Nährstoffversorgung wieder hergestellt, werden Histone reacetyliert und das Chromatin entfaltet sich, nimmt sogar eine offenere Konformation als in Kontrollzellen an. Zudem werden Gene ausgeschaltet, die für Histone kodieren. Kompaktes Chromatin verhindert Transkription, während die offene Chromatinstruktur nach dem Ende der Mangelversorgung einen vorübergehenden Anstieg der Genexpression verursacht. Mechanistisch wird die Chromatinverdichtung durch den Abfall in ATP und die Freisetzung von Polyaminen verursacht, die sich vom Zytoplasma in den Zellkern verlagern. Die Inhibierung von Histondeacetylasen und der Polyaminsynthese vor der Sauer- und Nährstoffrestriktion bewirkt eine weniger kompakte Chromatinstruktur und kann daher als Behandlungsmethode von ischämischen Herzerkrankungen in Erwägung gezogen werden. Dieses Projekt ist ein Beispiel für die dynamische Kapazität der Chromatinstruktur, auf Veränderungen des Milieus zu reagieren. Diese Studie verbindet den zellulären Energiehaushalt mit Chromatinverdichtung und gibt Einblick in die nukleare Architektur von Zellen. Dabei wurden mit Hilfe des Durchflusszytometers sieben verschiedene Histonmodifikationen nach kurzzeitiger Sauer- und Nährstoffrestriktion untersucht um die Chromatinzugänglichkeit an regulatorischen Elementen zu verdeutlichen. Darüber hinaus wurde anhand des Sidescatter Signals des Durchflusszytometers, welches proportional zur Granularität bzw. internen Komplexität der Zellen ist, die Chromatinverdichtung, die sich nicht, wie erwartet durch eine volumetrische Änderung der Gesamtzelle äußert, detektiert. Project Darko Castven „Detection of the Cancer Stem Cells in Liver Cancer“ (AG Marquardt, Universitätsmedizin der Universität Mainz): Cancer is constituted of heterogeneous population of cells differing in morphology, gene expression, proliferative capacity and invasiveness. This heterogeneity may occur as a result of hierarchical organization of the cancers, with a subset of cancer cells, also called cancer stem cells (CSCs), at their apex, which have the capacity of stemness. CSCs hypothesis potentially explains several phenomena of cancer such as resistance to chemo-radiation therapy, cancer recurrence and metastases. Also, CSCs are believed to play a key role in predicting the biological aggressiveness of cancer, due to their ability of selfrenewal and multi-lineage differentiation. Existence of the CSC has been experimentally confirmed in hepatocellular carcinoma (HCC). A number of cell surface markers have been proved useful for their detection, such as CD13, CD44, CD90, CD133 and EpCAM. There are several methodological approaches to identify expression of individual CSC markers or their combination, but most commonly used is flow cytometry. Another approach that allows us to investigate presence of the CSCs in HCCs is so called „Side population“ approach. This technique takes the advantage of the CSCs ability to actively pump out fluorescent dye Hoechst 33342 through ABCG2 membrane transporter, and all the cells that are negative for the dye are considered as a putative CSC. Hoechst 33342 is a DNA binding dye excited by UV laser, and detected at a blue and red emission spectrum (dual wavelength analysis). In our studies we are evaluating the effects of different chemotherapeutics on the CSC population in liver cancers, so for us, their detection and quantification is of big importance. We have been using both mentioned techniques, but with predominant orientation to the SP approach.
Publications
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