Novel cell culture systems to study Hepatitis B (HBV) and Hepatitis delta Virus (HDV) infections
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Hepadnaviren sind hepatotrope DNA-Viren. Ihr Prototyp, das humane Hepatitis B Virus (HBV), verursacht chronische Lebererkrankungen, denen jährlich etwa 750.000 Menschen zum Opfer fallen. Das humane Hepatitis D Virus (HDV) ist ein kleines RNA-Satellitenvirus Virus, welches die Hüllproteine von HBV nutzt, um sich in bereits HBV-infizierten Personen zu vermehren. Etwa 5 % der chronischen HBV Träger sind mit HDV und HBV koinfiziert. Da beide Viren die gleichen Hüllproteine besitzen nutzen sie vergleichbare, wahrscheinlich sogar identische Mechanismen um sich Eintritt in Hepatozyten zu verschaffen. Aufgrund der hohen Wirtsspezifität beider Viren und der Eigenschaft nur hochdifferenzierte Hepatozyten zu infizieren (was entscheidend von frühen Schritten der Infektion beeinflusst wird) gab es zum Zeitpunkt der Antragstellung keine „robusten“ Zellkultursysteme um den kompletten Replikationsmechanismus beider Viren zu untersuchen. Man war angewiesen auf primäre Hepatozyten von Menschen oder Tupaia belangeri oder einer Zelllinie (HepaRG) die in einem Wochen dauernden Prozess differenziert werden musste. Ziel unseres Antrags war es neue Zellkultursysteme zu etablieren, die es erlauben systematische Infektionsversuche mit HDV und HBV durchzuführen und damit die Möglichkeit bieten große Substanzbibliotheken im Hochdurchsatzverfahren auf neue antivirale Wirkstoffe hin zu untersuchen. Des Weiteren sollten die Systeme die Replikation via cccDNA über einen längeren Zeitraum unterstützen und auf einfache Weise genetisch manipulierbar sein. Damit könnte die Rolle von Wirtsfaktoren z.B. durch Überexpression oder Herabmodulation besser charakterisiert werden. Die vorhandenen Systeme (z.B. primäre menschliche Hepatozyten) erlauben das nur in sehr eingeschränktem Maß. Durch Verwendung eines markierten Liganden (Myrcludex B) des zum Zeitpunkt der Antragstellung noch unbekannten HBV Rezeptors konnten wir eine Zelllinie (WRL-68) identifizieren, die den HBV Rezeptor natürlicherweise exprimiert und Suszeptibilität für beide Viren aufwies. Ursprüngliche Zielsetzung unseres Antrags war es, diese Zelllinie weiter zu charakterisieren sowie andere suszeptible Zelllinien zu identifizieren. Parallel dazu verfolgten wir den davon unabhängigen Ansatz durch vergleichende Transkriptomanalysen differenzierter versus nicht differenzierter HepaRG Zelllinien den HBV Rezeptor zu identifizieren. Wir analysierten eine Reihe potentieller Rezeptorkandidaten, von denen sich sodium taurocholate co-transporting polypeptide (NTCP/SLC10A1) als bona fide Rezeptor für HBV herausstellte. Die Identifikation dieses Moleküls als spezifisches Bindemolekül von Myrcludex B gelang ebenfalls der Arbeitsgruppe von Wenhui Li aus Peking, die unserer Publikation vorausging. Mit der Entdeckung von NTCP als dem spezifischen Rezeptor für HBV und HDV eröffnete sich die Möglichkeit neue Zellkultursysteme auf andere Weise zu etablieren. Dies beruhte auf der Beobachtung, dass die bloße Expression von NTCP in Hepatomzelllinien ausreichte, diese unter bestimmten experimentellen Bedingungen mit hoher Effizienz suszeptibel für HBV und HDV zu machen. NTCP-exprimierende Zelllinien haben einen hohen anwendungsbezogenen Wert, da sie (i) zur Identifikation neuartiger Wirkstoffe genutzt werden können, (ii) erstmalig erlauben die Regulation der HBV Expression von seiner natürlichen Matrize, der cccDNA zu verstehen (iii) es ermöglichen immunologische Aspekte der HBV Infektion zumindest in vitro zu untersuchen (iv) die Grundlage für die Generation immunkompetenter Tiermodelle bilden. Das HBV Feld hat sich mit dieser Enddeckung wesentlich für neue Forschungsprojekte geöffnet und eine Reihe neuer Arbeitsgruppen hat sich etabliert. Erklärtes langfristiges Ziel ist es kurative Therapiestrategien („HBV-cure“) zu entwickeln. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die im Zuge der Projektförderung erzielten Ergebnisse wichtige Einsichten in die frühen Schritte der HBV- und HDV Infektion gebracht haben. Die Förderung bildete eine wesentliche Grundlagen für die Etablierung neuer Zellkultursysteme, die mittlerweile in den meisten international tätigen HBV-Laboratorien eingesetzt werden. Die Entdeckung von NTCP als Rezeptor bildet weiterhin die Grundlage für die Entwicklung immunkompetenter Zellkultursysteme.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Cyclosporin A inhibits hepatitis B and hepatitis D virus entry by cyclophilin-independent interference with the NTCP receptor. Journal of Hepatology 2014; 60:723-731
Nkongolo S, Ni Y, Lempp FA, Kaufman C, Lindner T, Esser-Nobis K, Lohmann V, Mier W, Mehrle S, Urban S
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.jhep.2013.11.022) - Entry of hepatitis B and C viruses Recent progress and future impact. Current Opinion in Virology 2014; 4: 58-65
Baumert TF, Meredith L, Ni Y, Felmlee DJ, McKeating JA, Urban S
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.coviro.2013.12.002) - Hepatitis B and D Viruses Exploit Sodium Taurocholate Co-transporting Polypeptide for Species-Specific Entry into Hepatocytes. Gastroenterology 2014; 146:1070–1083
Ni Y, Lempp FA, Mehrle S, Nkongolo S, Kaufman Chr, Fälth M, Stindt J, Königer C, Nassal M, Kubitz R, Sültmann H, Urban S
(Siehe online unter https://doi.org/10.1053/j.gastro.2013.12.024) - NTCP and Beyond: Opening the Door to Unveil Hepatitis B Virus Entry. Review Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 2892-2905
Watashi K, Urban S, Li W, Wakita T
(Siehe online unter https://doi.org/10.3390/ijms15022892) - Strategies to Inhibit Entry of HBV and HDV into Hepatocytes. Gastroenterology 2014;147:48-64
Urban S, Bartenschlager R, Kubitz R, Zoulim F
(Siehe online unter https://doi.org/10.1053/j.gastro.2014.04.030) - Hepatitis delta virus: insights into a peculiar pathogen and novel treatment options. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology 2016
Lempp FA, Ni Y, Urban S.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/nrgastro.2016.126)
