Untersuchung der Regulation von RNA Granula in Trypanosomen mit Hilfe eines neu etablierten RNA Granula-Aufreinigungsprotokolls.

• Antragstellerin: Professorin Dr. Susanne Kramer
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 208025595

Zytoplasmatische RNA Granula, zum Beispiel P-bodies und Stress Granula, sind Aggregate aus RNA und Protein, die die posttranskriptionale Genexpression in Eukaryoten regulieren. Die Funktion und Regulierung von RNA Granula ist immer noch weitgehend unbekannt, denn es ist bisher noch in keinem Organismus gelungen ist, diese Strukturen aufzureinigen.Wir haben in den letzten 2,5 Jahren das erste Protokoll für die biochemische Aufreinigung von Hungerstress-Granula etabliert. Das Protokoll profitiert von einer einzigartigen Eigenschaft der Afrikanischen Trypanosomen: wir verwenden das käfigartige Mikrotubuliskelett unterhalb der Zellmembran als ein molekulares Sieb. Mit Hilfe von Massenspektrometrie haben wir 464 potentielle Hungerstress-Granule Proteine identifiziert. Darunter sind viele bekannte und erwartete Granula-Proteine, aber drei viertel der Proteine haben keinen offensichtlichen Bezug zum mRNA Stoffwechsel. Darunter sind viele mit regulatorischen Funktionen. Für 15 von 32 getesteten Proteinen konnten wir die Lokalisation in Hungerstress-Granula durch die genetische Kopplung an eYFP nachweisen. Über RNA Sequenzierung haben wir auch die mRNAs der Granula quantifiziert. Dabei haben wir eine Gruppe von mRNAs identifiziert, die nicht in Granula zu finden ist: fast alle dieser mRNAs kodieren für ribosomale Proteine. Die Abwesenheit einer solchen mRNA von RNA-Granula konnten wir über Einzel-mRNA FISH bestätigen. Wir interessieren uns auch für einen zweiten RNA Granula Typ aus Trypanosomen: Granula die sich auf der zytoplasmatischen Seite des Zellkerns bilden, wenn die Reifung der mRNAs inhibiert wird (Nuklear-Peripherie-Granula). Diese Granula könnten die mRNA Qualität kontrollieren und haben sehr interessante Gemeinsamkeiten mit perinuklearen Keimzellgranula der Tiere. Wir konnten Zellkerne aufreinigen, bei denen die Granula noch vorhanden waren und warten im Moment auf die Ergebnisse der Massenspektrometrie.In der zweiten Förderperiode möchte ich die Regulierung von RNA Granula erforschen. In meinem Granula Proteom gibt es viele proteinmodifizierende Enzyme, zum Beispiel Kinasen, Phosphatasen und Methyltransferasen. Diese könnten die Zusammensetzung der Granula regulieren, indem sie die Fähigkeiten ihrer Zielproteine zur Lokalisation in Granula verändern. Ich möchte die verantwortlichen Signalwege verstehen. Ausserdem möchte ich verstehen, welche Mechanismen für den Ausschluss spezifischer mRNAs von Granula verantwortlich sind. Wir werden die Aufreinigung und Analyse der Nuklear-Peripherie-Granula fortsetzen und wollen ausserdem Granula aus dem pathologisch relevanten short stumpy Lebensstadium aufreinigen. Durch den Vergleich der Zusammensetzungen der verschiedenen Granula Arten können wir Proteine identifizieren, die für den jeweiligen Granula Typ spezifisch sind. Wir hoffen dass unsere Daten zu einem vollständigeren Verständnis von RNA Granula in Trypanosomen und anderen Eukaryonten beitragen werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen