Alternative Funktionen für die CRISPR-assoziierte Endonuklease Cas9

• Antragsteller: Professor Dr. Jörg Vogel
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Mikrobielle Ökologie und Angewandte Mikrobiologie
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 192503913

Im Rahmen der Charakterisierung des Typ II-CRISPR-Systems des Gram-negativen pathogenen Bakteriums Neisseria meningitidis konnten wir zeigen, dass dieses System eine stark angepasste CRISPR-Cas-Architektur besitzt und einen zuvor unbekannten prozessierungsunabhängigen CRISPR-RNA-Reifungsprozess verwendet. Das Typ II-CRISPR-System generiert mit Hilfe von nur einem Effektorprotein, dem Cas9-Protein, Doppelstrangbrüche in der DNA und lässt sich deshalb ausgezeichnet für RNA-basierte DNA-Spaltungen in vitro und für Genom-Editierungen in vivo anwenden. Daher werden wir den Cas9-Effektorkomplex (Cas9/tracrRNA/CRISPR-RNA) aus Neisseria als Werkzeug verwenden, um einerseits die Expression einzelner Gene zu modulieren und deren Einfluss auf vorhandene regulatorische Netzwerke zu untersuchen und andererseits zur globalen funktionellen Charakterisierung um Gene in Neisseria meningitidis einzeln zu mutieren. Vor kurzem konnte im Pathogen Francisella tularensis gezeigt werden, dass Cas9 zusammen mit tracrRNA und einer kleinen CRISPR-Cas-assoziierten RNA (scaRNA) auch post-transkriptionell Gene regulieren kann. Um zu verestehen ob es sich bei dieser Cas9-vermittelten endogenen Genregulation um einen konservierten Mechanismus handelt, werden wir nach alternativen Cas9-assoziierten RNAs in Neisserien suchen. Dazu werden wir mögliche alternative Ziel-RNAs von Cas9 nach in vivo-Crosslinking mit RNA-seq analysieren. Gleichzeitig sollen mit Hilfe affinitätsmarkierter tracrRNAs und CRISPR-RNAs unter Verwendung des MS2-Systems alternative Partner dieser RNAs präzipitiert werden. Darüber hinaus sollen Neisseria-Deletionsmutanten von einzelnen Komponenten des CRISPR-Cas Systems (Cas9, crRNAs and tracrRNA) hergestellt und systematisch mittels von bei uns etabliertem RNA-Seq analysiert werden. Eine gründliche Analyse von Transkriptionsmustern solcher Mutanten sollte die Identifizierung von Genen ermöglichen, die einer post-transkriptionellen Regulation durch CRISPR-Cas unterliegen.

• DFG-Verfahren: Forschungsgruppen
• Teilprojekt zu: FOR 1680: Unravelling the prokaryotic immune system