Durchflusszytometer
Final Report Abstract
Das Durchflusszytometer wurde dazu verwendet, Hochdurchsatzdurchmusterungstechnologien zum effizienten Design von Biokatalysatoren mit maßgeschneiderten Eigenschaften (Stabilität, Aktivität) zu entwickeln. Hierzu wurden zwei verschiedene Ansätze basierend auf ganzen Zellen und zellfrei synthetisierten Enzymen ausgewählt. Plattformen für die Hochdurdchsatzdurchmusterung basierend auf ganzen Zellen wurden für fünf Enzyme entwickelt (Arginin deiminase aus Pseudomonas plecoglossicida, ppADI; Phytase aus Yersinia mollaretii, YmPh; Lipase aus Bacillus subtilis, BSLA; Esterase aus Bacillus licheniformis, pNBEBL; Zellulase aus einer Metagenombibliothek). Die entwickelten Plattformen für alle fünf Enzyme wurden publiziert. Der zweite Ansatz für die zellfreie Expression von Enzymen basiert auf einer in vitro-Vesikel-Durchflußzytometrie-Technologie, die es ermöglicht den Zeitbedarf für eine Gelenkte Evolutionsrunde auf eine Woche zu reduzieren und Limitierungen in der Durchmusterungszahl durch Klonierungen mittels Einsatz linearer DNA-Template und zellfreier (in vitro) Expression zu eliminieren. Eine erste Validierung der Technologie wurden im Rahmen folgender Doktorarbeiten durchgeführt: 1. In vitro Durchmusterungtechnologie für eine Gelenkte Evolutionsrunde pro Tag. 2. Novel flow cytometer-based platforms for directed evolution. Basierend auf den bisherigen Ergebnissen werden im Rahmen eines Folgeantrags weitere Optimierungen der bisher entwickelten Plattformen zur Hochdurchsatzdurchmusterung mittels Durchflusszytometer angestrebt. In Zukunft wird der Fokus der Technologieentwicklung insbesondere auf der Durchmusterung von Metagenombibliotheken und der zellfreien Synthese von Enzymen in Kompartimenten liegen. Beide Methoden stellen einen wichtigen Meilenstein bei der routinemäßigen Anwendung Gelenkter Evolutionskampagnen in der Entwicklung neuer Biokatalysatoren dar.
Publications
- A fluorescent hydrogel-based flow cytometry high-throughput screening platform for hydrolytic enzymes. Chem Biol. 2014 Dec 18;21(12):1733-42
Pitzler C, Wirtz G, Vojcic L, Hiltl S, Böker A, Martinez R, Schwaneberg U
(See online at https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2014.10.018) - A flow cytometer-based whole cell screening toolbox for directed hydrolase evolution through fluorescent hydrogels. Chem Commun (Camb). 2015 May 21;51(41):8679-82
Lülsdorf N, Pitzler C, Biggel M, Martinez R, Vojcic L, Schwaneberg U
(See online at https://doi.org/10.1039/c5cc01791b)
