Mikroarray Kontakt-Printer
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Es wurde ein Histon-Peptid-Mikroarray entwickelt, der eine Vielzahl von Anwendungen ermöglicht. Dieser Mikroarray präsentiert überlappende Peptide aller humanen Histon- Isoformen zusammen mit modifizierten (methylierten, acetylierten, acylierten, phosphorylierten und citrullinierten) Varianten dieser Peptide. Neben der Analyse von enzymatischen Aktivitäten (Acetyl bzw. Methyl-Tranferasen, Histon-Deacetylasen und Kinasen) und der Charakterisierung von Bindungsspezifitäten (BROMO, Chromo- und 14-3-3-Domänen) ist besonders die Nutzung als Qualitätskontrolle für Antikörper, die in der epigenetischen Forschung eingesetzt werden, hervorzuheben. Dabei sind drei Fragen wichtig, die alle mit Hilfe dieses Mikroarrays beantwortet werden können. 1) Ist der Antikörper spezifisch für die Peptidsequenz oder gibt es sogenannte „off-targets“? 2) Ist der Antikörper spezifisch für die posttranlationale Modifikation? und 3) Wird die Antikörper- Bindung durch weitere posttranslationale Modifikationen innerhalb des Epitopes verändert? Außerdem wurde ein Acetylom-Mikroarray generiert, der die bekannten humanen Lysin- Acetylierungsstellen (6800) in Form von 13meren acetylierten Peptiden präsentiert. Als Kontrollen sind auf diesem Acetylom-Mikroarray die entsprechenden nicht-modifizierten Peptide mit immobilisiert. Unter Nutzung dieses Mikroarrays war es erstmals möglich, die Substrat-Spezifität aller humanen NAD+-abhängiger Lysin-Deacetylasen, sogenannter Sirtuine, umfassend zu charakterisieren und neue in vivo Substrate vorherzusagen. Weiterhin waren wir in der Lage, die Bindungsspezifität von acetyllysin-erkennenden Reagenzien, wie BROMO-Domänen oder pan-spezifischen anti-Acetyllysin-Antikörpern, zu analysieren. Zusätzlich konnte die substratspezifische Wirkung von Aktivatoren und Inhibitoren der Sirtuin-Aktivität aufgeklärt werden. In verschiedenen Kooperationen wurden maßgeschneiderte Peptid-Mikroarrays hergestellt, die die Analyse der Substratspezifität von humanen bzw. pflanzlichen Kinasen und Phosphatasen ermöglichte. Durch Verwendung überlappender Peptide, die aus Substratproteinen abgeleitet wurden, war die Kartierung von Phosphorylierungsstellen für die jeweiligen Kinasen möglich. Der Mikroarray-Kontaktprinter wurde für die Herstellung der beschriebenen Hoch-Dichte-Peptid-Mikroarrays verwendet.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- An acetylome peptide microarray reveals specificities and deacetylation substrates of all human Sirtuin isoforms. 2013, Nature Communications, 4, 2327-2336
Rauh, D., Fischer, F., Gertz, M., Lakshminarasimhan, M., Bergbrede, T., Aladini, F., Becker, C.F.W., Zerweck, J., Schutkowski, M., & Steegborn, C.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/ncomms3327) - Sirt1 activation by resveratrol is substrate sequence-selective. 2013. Aging, 5 (3)1-4
Lakshminarasimhan, M., Rauh, D., Schutkowski, M., & Steegborn, C.
(Siehe online unter https://doi.org/10.18632/aging.100542) - The SH2 domain interaction landscape. 2013, Cell Reports, 3, 1293-12305
Tinti, M., Kiemer, L., Costa, S., Miller, M., Sacco, F., Olsen, J. V., Carducci, M., Paoluzi; S., Langone, F., Workman, C. T., Blom, N., Machida, K., Thomson, C. M., Schutkowski, M., Brunak, S., Mann, M., Mayer, B. J., Castagnoli, L., & Cesareni, G.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.celrep.2013.03.001) - ChloroPhos1.0" identifies new phosphorylation targets of plastid casein kinase II (pCKII) in Arabidopsis thaliana. 2014, PLOSone, 9(10):e108344
Schönberg, A, Bergner, E., Helm, S., Agne, B., Dünschede, B., Schünemann, D., Schutkowski, M., Baginsky, S.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1371/journal.pone.0108344) - ,Peptide Microarrays for Profiling of Epigenetic Targets. Chapter 9 in Epigenetic Technological Applications, Edited by Y. George Zheng, Academic Press, Elsevier, 2015
Masch, A., Reimer, U., Zerweck, J. & Schutkowski, M.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/B978-0-12-801080-8.00009-0) - Identification of peptidic tyrosine kinase substrates for the human Myt1 kinase via peptide microarray. 2015, Bioorg. Med. Chem., 23(15), 4936-4942
Rohe, A., Masch, A., Greiner, S., Henze, C., Platzer, C., Ihling; C., Erdmann, F., Schutkowski, M., Sippl, W., & Schmidt, M.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.bmc.2015.05.021)
