Exploring the structural and mechanistic basis of H+, Na+, and K+ coupling in secondary active glutamate transporters
Final Report Abstract
Glutamattransporter finden sich in allen drei Domänen des Lebens und translozieren vorzugsweise Glutamat oder Aspartat, aber auch andere Aminosäuren oder niedermolekulare Substanzen über die Membran, in dem sie existierende Gradienten von verschiedenen Kationen nutzen. Das auf molekularer Ebene am besten untersuchte Homolog ist GltPh aus Pyrococcus horikoshii. Das Protein bildet ein Homotrimer, in dem pro Protomer der Transport von einem Aspartat an den Transport von drei Na+ -Ionen gekoppelt ist. Kristallstrukturen von GltPh zeigten, dass jedes Protomer aus einer stabilen Trimerisierungsdomäne sowie einer anscheinend flexiblen Transportdomäne besteht, welche sich zum Transport des Substrats etwa 18 Å über die Membran bewegt. Die Bindung von Aspartat und Na+ findet vermutlich durch das Öffnen und Schließen auswärts- und einwärts gerichteter helikaler Haarnadelstrukturen statt, wobei MD-Simulationen ergaben, dass zunächst zwei Na+ binden, die die Bindetasche für das Aspartat formen, wodurch letztendlich auch das dritte Na+ binden kann. Somit wäre die Ionenkopplung des Aspartattransports gewährleistet. In diesem Projekt wurde zunächst die globale Dynamik der Transportdomänen in Abhängigkeit vom Substrat mittels ESR-Spektroskopie eingehend untersucht. Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass die Trimerisierungsdomänen wie vorgeschlagen sehr immobil sind, während die Transportdomänen sehr heterogen verteilt sind und verschiedenste Konformationen unabhängig vom Substrat durchlaufen. In Detergenz waren hierbei die extremen Konformationen, die auch die Kristallstrukturen zeigten, am häufigsten besetzt. Die Rekonstitution von GltPh in Liposomen führte zu einer veränderten Verteilung der möglichen Konformationen hin zu intermediären Strukturen, doch blieb die Abstandsverteilung unverändert breit. Wir schlossen auf nahezu einheitliche Gleichgewichtskonstanten der unterschiedlichen Konformationen, woraus eine nahezu ständige, substratunabhängige Bewegung der Transportdomänen resultiert. Da die ESR-Messungen stets Messungen an Schnittmengen darstellen und hieraus kein Transportzyklus abgeleitet werden konnte, wurden die beobachteten Konformationsänderungen der Transportdomänen in weiteren Versuchen mittels Einzelmolekül-FRET-Messungen am rekonstituierten Protein untersucht. Hierbei zeigte sich für die untersuchte, mit ALEX-Fluorophoren markierte Variante, dass die Transportdomänen im Apo-Zustand zwischen zwei distinkten Konformationen pendelten, der bekannten auswärts gerichteten und einer unbekannten, intermediären Konformation. Durch Zugabe von Na+ und dem Anlegen eines Membranpotentials orientierten sich die Transportdomäne auswärts gerichtet und oszillierten wiederum, nun aber zwischen der auswärts gerichteten und selbiger intermediären Konformation. Erst die zusätzliche Gabe von Aspartat führte zu einem kompletten Transportzyklus, bei dem eine Domäne alle drei Konformationen durchlief, um so das Substrat über die Membran zu transportieren. Erstmals konnte somit ein vollständiger Transportzyklus der Transportdomäne in Abhängigkeit vom Substrat aufgezeigt werden, bei dem die intermediäre Konformation eine Schlüsselfunktion einzunehmen scheint. Abschließend wurde die Bindungsdynamik von Aspartat und Na+ an GltPh mittels Tryptophan-Fluoreszenz-Methoden untersucht. Die Substratbindung stellt eine Grundvoraussatzung für den Transport dar und sollte zum Erstellen eines möglichst vollständigen, zeitauflösenden Transportzyklus untersucht werden. Durch die Messungen wurde die bereits bekannte hohe, Na+ -abhängige Affinität der Aspartatbindung bestätigt und durch hohe kon- und koff-Wert (Nahe am Diffusionslimit) begründet. Zumindest zwei Na+ banden mit niedriger Affinität auch in Abwesenheit von Aspartat an GltPh, während Stopped-flow-Messungen eindeutig darlegten, dass Aspartat erst an GltPh binden konnte, nachdem Na+ gebunden war. Dieses entspricht den MD-Simulationen, wobei unklar blieb, wann und unter welchen Bedingungen das dritte Na+ bindet. Die ermittelten Zeitkonstanten der Na+ - und Aspartatbindung waren aber alle samt so groß, dass sie nicht transportlimitierend sein können.
Publications
- (2013) Conformational heterogeneity of the aspartate transporter GltPh. Nat. Struc. Mol. Biol., published online
Hänelt, I., Wunnicke, D., Bordignon, E., Steinhoff, H.J. & Slotboom, D.J.
(See online at https://doi.org/10.1038/nsmb.2471)
