Immortalisierte Darmepithelzelllinien des Schweins als in vitro-Modell zur Erforschung der Pathogenitätsmechanismen Zoonose-relevanter Erreger
Final Report Abstract
Die im Projekt formulierten Zielsetzungen konnten zum Großteil erreicht werden, aufgrund der unzureichenden epithelialen Differenzierung der neu immortalisierten porcinen Darmzelllinien war aber ihre Nutzung als In-vitro-Modell zur Erforschung von Pathogenitätsmechanismen Zoonose-relevanter Erreger nicht möglich. Die Etablierung von neu immortalisierten Zelllinien aus fetalen porcinen Dickdarmepithelzellen gelang mittels der Kombination verschiedener Techniken zur Zellisolierung und –kultivierung. Dadurch konnte isolierte Kryptenzellen des Dickdarms problemlos mit dem „SV40 large T antigen“ transduziert und in der Folge mehrfach passagiert und reproduzierbar kryokonserviert werden. Die Selektion von Einzelklonen zur weitergehenden Analyse stellte ebenfalls kein Problem dar, wodurch neben dem PCR-basierten Nachweis des erfolgreichen Einbaus des „SV40 large T antigens“ auch das Ausmaß an der zellulären Ausbildung von Cytokeratinen als epitheliale sowie Vimentin als mensenchymaler Marker mittels Immunhistochemie ermittelt werden konnte. Hierbei zeigte sich, dass die beiden untersuchten Zellklone Vimentin-positiv waren, was auf eine nur unzureichende epitheliale Differenzierung hinweist. Eine weiterführende morphologische Untersuchung der Zellen durch Transmissionselektronenmikroskopie bestätigte diesen Befund, da trotz deutlicher Ausbildung von Mikrovilli und Zell-Zellkontakten kein apikaler Bürstensaum als Indikator einer Polarisation erkennbar war. Die generelle Nutzung der an Zellkulturen adaptierten Ussingkammeranlage für elektrophysiologische Untersuchungen war unter Verwendung der etablierten humanen CaCo2-Zelllinie schnell und reproduzierbar etabliert worden. Dabei wurden die stimulierten elektrogenen Transporte von Glucose und Chlorid als funktionelle Messgrößen verwendet, die auch Markercharakter für intestinale Epithelzellen haben. Die Änderungen im Kurzschlussstrom nach Stimulation sowie Höhe des transzellulären Widerstands der verwendeten konfluent gewachsenen Zellen entsprachen dabei den Literaturangaben. Die dabei gewonnenen grundlegenden Kenntnisse dieser Etablierungsversuche bezüglich der einzusetzenden Substratkonzentrationen oder der Konfluenzdauer der Kulturen konnten allerdings nicht auf die ebenfalls bereits bestehende porcine Darmepithelzelllinie IPEC-J2 übertragen werden. Elektrogene Transportereignisse und transzelluläre Widerstände wiesen bei diesen Zellen sehr hohe Varianzen zwischen den untersuchten Wells auf, die auch durch Modifikationen in den Kulturbedingungen nicht stabilisiert werden konnten. Im Vergleich zu den CaCo2-Zellen war die Expression relevanter Transporter (SGLT1, GLUT2, CFTR) in IPEC-J2-Zellen deutlich heterogener, bzw. bei PepT1 nicht nachweisbar. Eine vorangestellte Expressionsanalyse dieser Transporter bei neu immortalisierten porcinen Dickdarmepithelzelllinien zeigte ebenfalls eine hohe Streuung in der relativen mRNA-Menge von SGLT1, GLUT2 und CFTR, während PepT1 wie bei den IPEC-J2-Zellen nicht nachgewiesen werden konnte. Die funktionelle Überprüfung einer ausgewählten Zelllinie machte deutlich, dass diese Zellen prinzipiell in der Lage sind Glucose und Chlorid elektrogen zu transportieren. Allerdings waren weitergehende Untersuchungen und Experimente mit Zoonose-relevanten Erregern aufgrund zu geringer transepithelialer Widerstandswerte und oftmals geringer Adhärenz der konfluenten Zellrasen nicht durchführbar. Mittels semiquantitativer PCR konnte diesbezüglich eine ungenügende Ausbildung von Tight Junctions zwischen den Zellen als mögliche Ursache ermittelt werden. Ähnlich wie die morphologischen Untersuchungen und Markerproteinanalysen deutet dieser Befund auf eine unzureichende Differenzierung der Epithelzellen hin. Die für das Projekt benötigten zellbiologischen und elektrophysiologischen Techniken konnten etabliert werden. Lediglich die epitheliale Differenzierung der neuen porcinen Dickdarmzelllinien stellt zurzeit ein Problem dar, das über Modifikationen in den Kulturbedingungen gelöst werden könnte.
