HPLC-Q-ToF-Analysegerät
Final Report Abstract
Metabolomics: Am IBVT werden Arbeiten zur Quantifizierung intrazellulärer Metabolite des Zentralstoffwechsels, ausgewählter Biosynthesewege sowie von Nukleotiden und Reduktionsäquivalenten durchgeführt. Kürzlich gelang die Entwicklung einer neuartigen, vielversprechenden Methode. Diese metabolic profiling Arbeiten an einem HPLC-QQQ-MS Gerät wurden von Anfang an so entwickelt, dass die verwendete chromatographische Methode auch auf dem HPLC-Q-ToF Gerät dieser DFG Finanzierung für metabolic profiling und metabolic fingerprinting Analysen einsetzbar ist. Peptid-Analytik: Neben der Entwicklung der o.g. metabolomics Methode wurde das Q-ToF Gerät intensiv für Peptid- und Proteinanalysen eingesetzt. Dabei wurde insbesondere die Geräteeigenschaft der akkuraten Massebestimmung (< 5 ppm) ausgenutzt. Quantifizierung intrazellulärer Proteinfragmente: Bislang existieren nur Schätzungen darüber ob und in welchem Umfang monoklonale Antikörper hergestellt in Chinese Hamster Ovary (CHO) Zellen bereits während ihres Entstehungsprozesses in den Säugerzellen teilweise degradiert werden. Um dieser Frage nachzugehen wurden umfangreiche Kultivierungen mit IgG1 produzierenden CHO durchgeführt und das Protein durch Verstoffwechslung von 13C Lysin markiert. Mittels Q-ToF wurden anschließend alle Proteinfragmente im Innern der Zellen gemessen und – dank Sequenzvergleich mit dem Zielprodukt – Fragmente aus dem Abbau des Antikörpers identifiziert und quantifiziert. Die Modellbasierte Analyse führte zu der Aussage, dass selbst moderate Produktions- und Wachstumsbedingungen einen Abbau von 3% der Proteine aufweisen. Kürzlich gelang die intra- und extrazelluläre Quantifizierung von Dipeptiden. Diese Arbeiten bilden die Grundlage für einen entsprechenden eBio-Forschungsantrag beim BMBF. In vitro Proteinsynthese: Im Rahmen von synthetisch-biologischen Arbeiten der zellfreien Proteinsynthese wurde und wird das Q-ToF eingesetzt, um die spezifische Proteinstabilität ribosomaler Proteine sowie die Synthese produzierter Peptide nachzuweisen. Einsatz des Gerätes in Kooperation mit anderen Instituten, Oligosaccharid-Abbau: In Kooperation mit dem Institut für Industrielle Genetik wurde der Abbau von Galactan untersucht, dessen Produkte als Probiotika interessant sind. Die Untersuchung der erzeugten Polysaacharide nach β-1,4-Galactanase Zugabe (heterolog hergestellt in E. coli aus B. subtilis, ganB) zeigten eindeutig Di-, Tri- und Tetra-saccharide. Dabei wurde die hohe Massengenauigkeit des Gerätes sowie die software-gestützte Fragmentierung der Spektren ausgenutzt. Nachweis von Diclofenac: In Kooperation mit dem Institut für Technische Biochemie wurde der Nachweis bzw. Abbau des Analgetikums Diclofenac unter Simulation potenzieller, biologischer Abbausituationen untersucht. Es war möglich fünf Verbindungen aus der Droge zu identifizieren. Eine der Modifikationen des Substrates wurde durch Tandem-MS-Spektren als Carboxylation, die nicht in der Literatur bisher berichtet wurde, bestätigt. Weitere Tests werden aktuell durchgeführt. Identifizierung eines Quorum-Sensing Botenstoffs: Am Institut für Mikrobiologie und Biotechnologie der Universität Ulm werden Untersuchungen zum Quorum sensing in mikrobiellen Populationen von Listeria monocytogenes (in Biofilmen) durchgeführt. Im Rahmen dieser Studien wurde ein entsprechendes Peptid (Agr) überexprimiert, dessen Struktur mit Hilfe des Q-ToF Gerätes analysiert werden sollte. Es gelang die Struktur durch Peptidfragmentierung unter Verwendung der hohe Massengenauigkeit zu bestätigen. Es war zudem möglich, zwei Konformere des Peptids in den Kulturproben zu identifizieren. Zukünftige Experimente werden unternommen, um die aktive Konformation zu überprüfen.
Publications
- (2015) Alkaline conditions in hydrophilic interaction liquid chromatography for intracellular metabolite quantification using tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry Volume 475, 15 April 2015, Pages 4-13
Teleki A., Sanchez-Kopper A., Takors R.
(See online at https://doi.org/10.1016/j.ab.2015.01.002) - (2015) Monitoring Intracellular Protein Degradation in Antibody Producing Chinese Hamster Ovary Cells. Engineering in Life Science Vol 15 Issue 5, Special Issue: Cell culture engineering, July 2015, Pages 499-508
Rimbon J., Sanchez-Kopper A., Wahl A., Takors R.
(See online at https://doi.org/10.1002/elsc.201400103)
