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Kontrolle des Rotationsmechanismus einer einzelnen FoF1-ATP synthase in freitragenden Lipiddoppelschichten

Subject Area Biophysics
Term from 2011 to 2016
Project identifier Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 196663069
 
Final Report Year 2019

Final Report Abstract

Das DFG-Projekt „Kontrolle des Rotationsmechanismus einer einzelnen FoF1-ATP Synthase in freitragenden Lipiddoppelschichten” konnte nur in Teilen erfolgreich durchgeführt werden. In der ersten Phase bis 2014 wurde die Herstellung der BLM-Probenkammern, die von unserem Kooperationspartner Prof. Dr. Noji in Tokio entwickelt wurde, dort und auch in Jena ausprobiert. Die Schwierigkeiten dieser manuellen Präparation der BLM stellten sich jedoch schon beim Laborbesuch in Tokio heraus, sodaß der mit dem Projekt betraute Postdoc Dr. McMillan seinen wissenschaftlichen Fokus auf die Erzeugung neuer Mutanten der FoF1-ATP Synthase und eine Mithilfe bei der Aufreinigung des Enzyms in Jena gelegt hat. Stattdessen haben wir uns auf eine andere Art der BLM-Erzeugung mit Hilfe des integrierten Systems Bilayer Explorer von Ionovation ab 2015 konzentriert. Deren Probenkammern mit Pumpsystem zur Befüllung der Probenkammern sowie eine gleichzeitige Messung der Leitfähigkeit erlaubten die automatisierte Erzeugung der BLM aus verschiedensten Lipiden und Lipidmischungen. Das Ionovation BLM-System wurde ab 2016 auf ein selbstgebautes Weitfeldmikroskop für EMCCD-Detektion einzelner Fluorophore montiert. Der Gesamtaufbau ist somit für die gleichzeitige optische Detektion einzelner FoF1-ATP Synthase in der freitragenden Lipiddoppelschicht und die elektrophysiologische Kontrolle bzw. den Antrieb der Enzyme in der BLM vorbereitet. Ein wesentlicher experimenteller Fortschritt konnte nicht erreicht werden, nämlich die Fusion von Liposomen oder Vesikeln mit planaren Lipiddoppelschichten. Verschiedene publizierte Anleitungen und unterschiedliche Methoden wurden evaluiert. Die Etablierung eines verläßlichen Protokolls zur Fusion von Proteoliposomen mit der BLM innerhalb eines Zeitraums von beispielsweise 30 Minuten ist bisher nicht gelungen. Wenn jedoch Ionenkanäle als Membranproteine untersucht werden, ist ein elektrophysiologischer Nachweis einer Fusion möglich, und eine daran anschließende optische Analyse von FRET-markierten Proteinen durchaus erfolgversprechend. In Zukunft soll das Ionovation BLM-System auch für biophysikalische Einzelmolekül-Untersuchungen von komplexen Lipidmischungen ohne Membranproteine genutzt werden, bspw. mit Hilfe eines neuen konfokalen Zweiphotonen-homoFRET-STED Mikroskops der AG. Andere Ziele des DFG-Projekts konnten im gegebenen erweiterten Zeitrahmen erreicht werden. Es wurden neue Mutanten der FoF1-ATP Synthase mit Halo-tag oder mit mNeonGreen am C-terminus der a-Untereinheit als Alternativen zu dem existierenden EGFP- bzw. SNAP-tag erzeugt. Diese Enzyme wurden präpariert und die Fluoreszenzmarkierung gemessen. Der Halo-tag konnte - wie auch der SNAP-tag - nicht bzw. nur gering markiert werden (möglicherweise denaturieren diese Proteine unter speziellen Bedingungen der FoF1-ATP Synthase Präparation mit Reinigungsschritten bei 4°C oder bei hohen Ionenstärken), aber mNeonGreen ist photophysikalisch ein erheblich besserer Fluoreszenzmarker als EGFP. Unsere Proteinpräparationen erfolgen nun auf neueren FPLC-Systemen und sind erheblich sauberer. Die Liposomenpräparationen und die ATP Syntheseraten der rekonstituierten Enzyme sind sehr repoduzierbar. Mit den beantragten EOD- und FPGA-Komponenten konnte ein erster schneller konfokaler ABELtrap realisiert werden, sodaß die Beobachtungszeit einzelner FRET-markierter FoF1-ATP Synthasen in freier Lösung auf mehrere Sekunden verlängert wurde. Der ABELtrap ist eine hervorragende Alternative zur BLM-Immobilisierung für smFRET-Messungen unter Bedingungen der ATP Hydrolyse, mit der Möglichkeit zu gleichzeitiger Fluoreszenzlebensdauer- und -Anisotropiemessung der FRET-markierten Enzyme.

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