Pathophysiologische Rolle von endogenen renalen Entzündungsinhibitoren: growth arrest specific gene-1 und developmental endothelial cell locus-1
Final Report Abstract
Die Zahl der Patienten mit Nierenversagen wächst ständig. Entzündliche renale Erkrankungen resultieren dabei häufig in der Entstehung einer terminalen Niereninsuffizienz. Bisher sind zahlreiche Faktoren beschrieben, die die Entzündungsreaktion verstärken und zu einer Progression der Erkrankung führen. Dagegen sind endogene renale Inhibitoren, die zum Abklingen dieser Prozesse führen, weitgehend unbekannt. In diesem Projekt sollte deshalb die Funktion zweier bisher nicht charakterisierter Faktoren, des growth arrest specific gene 1 (Gas1) und des developmental endothelial cell locus-1 (Del1) in Nierenerkrankungen untersucht und dabei die Hypothese verfolgt werden, dass die Überexpression von Gas1 und Del1 einen sinnvollen, neuen Therapie-Ansatz darstellt. Die Hypothese sollte durch 5 experimentelle Ansätze geprüft werden: 1) Untersuchungen zur Expression von Gas1 und Del1 in Nierenerkrankungen, 2) in vitro Analysen zur Funktion des extrazellulären Gas1-Proteins, 3) in vitro Analysen zur Funktion und Interaktion von Gas1 und Del1 in Mesangialzellen und Fibroblasten, 4) Identifikation der Funktion beider Proteine in experimentellen Nierenerkrankungen sowie 5) die in vivo Überexpression von Gas1 und Del1 in experimentellen Tiermodellen als potentielle neue therapeutische Intervention. Im ersten Abschnitt konnten wir demonstrieren, dass die glomeruläre Gas1 mRNA-Expression u.a. in Biopsien von Patienten mit IgA-Nephropathie reduziert ist. Die immunhistochemische Untersuchung von humanem Biopsie-Material ergab eine überwiegend podozytäre Gas1-Expression und eine Bestätigung der reduzierten Gas1 Expression in Patienten mit IgA-Nephropathie. In Mesangialzellen in vitro konnte die Sekretion eines löslichen Gas1 Proteins nachgewiesen werden. Die Induktion eines Wachstumsarrestes resultierte in einer Überexpression von Gas1 und einer verstärkten Sekretion. ADAM-10 und -17 konnten als verantwortliche Proteasen für das Shedding von Gas1 in proliferierenden (ADAM-17) und wachstums-arretierten Mesangialzellen (ADAM-10 + -17) identifiziert werden. Auch in der anti-Thy1.1 Nephritis konnte ein Anstieg der glomerulären ADAM-10 und -17 mRNA Expression sowie der glomerulären Aktivität der ADAM-Proteasen zwischen Tag 2 und 9 nach Krankheitsinduktion nachgewiesen werden. Hierbei ist ADAM 17 sowohl in gesunden als auch nephritischen Glomeruli aktiv, während eine ADAM 10 Aktivität nur in nephritischen Glomeruli nachgewiesen werden konnte. Gas1 ohne GPI-Anker inhibierte die Proliferation von Mesangialzellen, während die Induktion der Mesangialzell-Proliferation durch PDGF-B und –D die Gas1 mRNA-Expression reduzierte. Während des Zeitverlaufes der anti-Thy1.1 Nephritis einem experimentellen Modell der mesangioproliferativen Glomerulonephritis ist die glomeruläre Gas1 mRNA Expression vor Beginn der Mesangialzellproliferation reduziert und nimmt während des weiteren Verlaufs der Erkrankung stetig zu. Die systemische Überexpression eines Gas1/Fc-Fusionsproteins resultierte in einem reduzierten renalen Schaden, einer Abnahme der glomerulären Mesangialzell-Aktivierung und –Proliferation sowie eine reduzierte Entzündungsreaktion im Vergleich zu den Kontroll-transfizierten nephritischen Ratten. Auch im Zeitverlauf der unilateralen Ureterligatur (UUO), einem experimentellen Modell der renalen Fibrose, konnte eine schwache Reduktion der Gas1 mRNA-Expression am Tag 1, gefolgt von einem kontinuierlichen Anstieg der Gas1 mRNA-Expression bis zum Tag 14 nach Krankheitsinduktion beobachtet werden. In der Ratten-Fibroblasten-Zelllinie NRK49F wird Gas1 exprimiert und sezerniert, wobei eine Wachstums-Arretierung die Gas1 Expression und Sekretion erhöhte. Die Überexpression eines Gas1/Fc-Fusionsproteins in NRK49F resultierte in einer Aktivierung des SHH-Signalweges und führte (unerwartet) zu einer gesteigerten Expression von α- SMA. Die systemische Überexpression eines extrazellulären Gas1/Fc-Fusionsproteins im Modell der UUO der Ratte konnte jedoch keine Veränderungen der Krankheitsprogression induzieren. Del1 wird in der gesunden humanen Niere in vaskulären und einigen wenigen glomerulären und tubulären Zellen exprimiert. In der chronischen humanen Transplant-Nephropathie kommt es zu einer starken Überexpression des Del1-Proteins in tubulären und parietalen Epithelzellen sowie in infiltrierenden Zellen. Eine reduzierte glomeruläre Del1 mRNA-Expression konnte in der fokalen segmentalen Glomerulosklerose nachgewiesen werden, während die glomeruläre und tubuläre Del1-Expression in Patienten mit einer rapid progredienten Glomerulonephritis erhöht ist. Del1-defiziente Mäuse entwickeln bis zu einem Alter von 14 Wochen keinen spontanen renalen Phänotyp. Nach Induktion einer renalen tubulo-interstitiellen Fibrose (Modell der unilateralen Ureterobstruktion) oder der nephrotoxischen Nephritis, einem experimentellen Modell mit einer Aktivierung der Parietalzellen sowie der Entstehung von extrakapillären Proliferaten, zeigten Del1-defiziente Mäuse eine verminderte Akkumulation von Matrixproteinen im renalen Kortex im Vergleich zu wildtyp-Kontrolltieren. Unerwartet konnte in beiden Modellen eine reduzierte Anzahl an ERHR-3-positiven Makrophagen sowie eine reduzierte CCL-2 mRNA Expression im renalen Kortex von Del1-defizienten Mäusen im Vergleich zu Kontrolltieren detektiert werden, während die Gesamtanzahl an F4/80- positiven Makrophagen unverändert blieb. Die pro-inflammatorische Aktivität von Del1, die bisher in keinem anderen inflammatorischen Modell beschrieben wurde, konnte auch in einer milderen renalen Entzündung (Injektion mit Lipopolysacharid) bestätigt werden. In vitro Untersuchungen des zugrunde liegenden Mechanismus ergaben, dass Del1-defiziente tubuläre Zellen im Vergleich zu Wildtyp-Zellen schneller proliferieren und weniger Fibronektin exprimieren, dessen Expression durch TGF-β nicht verstärkt werden konnte. In Fibroblasten induzierte rekombinantes Del1 Protein die CCL-2 mRNA Expression und Sekretion und verstärkte die mRNA Expression von α-smooth muscle actin und VCAM-1. Eine pathophysiologische Aktivität von Del1 ist nur im Tubulointerstitium aber nicht im Glomerulus nachweisbar. Zusammenfassend konnte in diesem Projekt Gas1 als ein neuer endogener Inhibitor der Mesangialzellproliferation und –aktivierung in vitro und in vivo identifiziert werden, der einen potentiellen Ansatzpunkt für die Entwicklung einer neuen Therapie-Strategie darstellen könnte. Dagegen zeigte Del1 überraschend pro-inflammatorische Aktivitäten in entzündlichen Nierenerkrankungen.
Publications
- (2012). A Novel, Dual Role of CCN3 in Experimental Glomerulonephritis: Pro-Angiogenic and Antimesangioproliferative Effects. Am J Pathol 180, 1979-1990
van Roeyen, C.R., Boor, P., Borkham-Kamphorst, E., Rong, S., Kunter, U., Martin, I.V., Kaitovic, A., Fleckenstein, S., Perbal, B., Trautwein, C., Weiskirchen, R., Ostendorf, T., Floege, J.
(See online at https://doi.org/10.1016/j.ajpath.2012.01.031) - (2013). Growth arrest-specific protein 1 is a novel endogenous inhibitor of glomerular cell activation and proliferation. Kidney Int. 83, 251-263
van Roeyen C.R., Zok, S., Pruessmeyer, J., Boor, P., Nagayama, Y., Feckenstein, S., Cohen, C.D., Eitner, F., Gröne, H.-J., Ostendorf, T., Floege J.
(See online at https://doi.org/10.1038/ki.2012.400)
