Strukturanalysen des humanen Proteins HSP70 (Hitzeschockprotein 70 kDa) zur Untersuchung seiner Rolle in der spezifischen Immunabwehr.
Final Report Abstract
Hitzeschockproteine (HSP) sind ubiquitär vorkommende Proteine mit multiplen Funktionen. HSP besitzen die Fähigkeit antigene Peptide zu binden und die MHC Klasse II-vermittelte Aktivierung von humanen CD4+ T-Zellen zu beeinflussen. In dem hier verfolgten Ansatz wurde die Rolle des humanen Proteins Hsp70 (Hitzeschockprotein 70 kDa) in der spezifischen Immunabwehr anhand von Mutationen in der Substratbindungsstelle und Verkürzungsmutationen untersucht. Mit Hilfe von Sequenzvergleichen wurden zwei für eine Substratbindung wichtigen Aminosäuren im humanen Hsp70 identifiziert und zielgerichtet mutiert. Es wurde Alanin an Position 405 und Valin an Position 437 mittels zielgerichteter Mutagenese jeweils durch Glycin ersetzt. Diese Mutationen wurden als A405G und V437G bezeichnet. Zusätzlich wurde aus der synthetisierten DNA eine C- terminale Verkürzungsmutation (AS) generiert. In quantitativen Bindungsassays (DELFIA) wurden die verschiedenen Mutationen hinsichtlich ihrer Bindungsaktivitäten getestet. Es konnte gezeigt werden, dass beide einzelnen Mutationen in der Substratbindedomäne (A405G und V437G) zu einer signifikanten Minderung der Substratbindeaktivität führen. Die Deletion der C-terminalen Domäne hatte keinen Einfluss auf die Substratbindung. Eine Bindung an HLA-DR blieb bei allen veränderten Hsp70 Molekülen unverändert im Vergleich zum Wildtyp Hsp70 (A1A). Somit konnte die Hypothese, dass eine Bindung von Hsp70 an HLA-DR unabhängig von der Substratbindedomäne stattfindet, bestätigt werden. Da das AS-Fragment ohne C-Terminus ebenfalls an HLA-DR bindet, konnte der C-Terminus als Bindungsstelle an HLA-DR ausgeschlossen werden. Zusammen mit vorangegangenen Untersuchungen, die eine Bindung von HLA-DR an das ATPase-Fragment von Hsc70 (Hsc70-ATPf) zeigen, scheint eine Interaktion zwischen HLA-DR und Hsp70 vermutlich im Bereich der ATPase-Domäne von Hsp70 zu liegen. Aufgrund der Ergebnisse wäre eine direkte Übertragung eines Hsp70-gebundenen Substrats, z.B. eines Antigens, auf ein HLA-DR-Molekül, das im Bereich der ATPase-Domäne am Hsp70 bindet, in einem tertiären Komplex denkbar. Die verstärkte Proliferation antigenspezifischer T-Zellen durch Hsp70-gebundene Peptide im Vergleich zu ungebundenen Peptiden, wie in unserer Arbeitsgruppe gezeigt, könnte dadurch eventuell erklärt werden. Eine weitere Ursache der verstärkten Proliferation von T-Zellen, die durch eine Komplexierung eines Antigens an Hsp70 ausgelöst wird, könnte eine beschleunigte Aufnahme der Hsp70:Peptid- Komplexe in die antigenpräsentierende Zelle sein. Es wurde deshalb die Aufnahme von HSP:Peptid-Komplexen durch Monozyten als antigenpräsentierenden Zellen untersucht. Dazu wurden die intrazellulären Mengen von Komplexen aus Hsp70 und FITC-markierten Fragmenten des Tetanustoxins (FTT947-966-Peptid) bzw. FTT947-966-Peptid alleine mit Hilfe der Durchflusszytometrie analysiert. Durch Zeitreihenuntersuchungen wurde die Aufnahmegeschwindigkeit der Komplexe bzw. Peptide verglichen und analysiert, welchen Einfluss verschiedene Peptid- bzw. HSP-Konzentrationen haben. Dabei konnte festgestellt werden, dass unter allen analysierten Bedingungen keine schnellere und effektivere Aufnahme von an Hsp70 komplexiertes FTT947-966-Peptid stattfindet. Außerdem ist eine Analyse der oben genannten Komplex- und Peptidaufnahme mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie erfolgt, um weitere Informationen zur Interaktion der Komplexe mit Monozyten und deren intrazellulärer Lokalisation zu liefern. Nach Etablierung der Methode konnten die FTT947-966-Peptide sowohl bei Aufnahme des Peptids alleine als auch im Komplex mit Hsp70 in späten Endosomen detektiert werden. In Proliferationsversuchen mit CD4+ T-Zellen eines HLA-DRB1*11 positiven gesunden Spenders und dem Tetanuspeptid TT947-966 konnte die verstärkte Proliferation der T-Zellen bei Komplexierung des Peptids an Hsp70 des Wildtyps (A1A) bestätigt werden. Die Komplexierung des Peptids an alle veränderten Hsp70 Moleküle zeigte diesen Effekt nicht. Dadurch konnte für die punktmutierten Hsp70 Moleküle die DELFIA-Ergebnisse bestätigt werden. Das AS-Fragment scheint jedoch wahrscheinlich aufgrund einer mangelnden Zellaufnahme in die antigenpräsentierende Zelle bei fehlender C-Domäne nicht in der Lage zu sein, die Proliferation von T-Zellen zu verstärken, obwohl eine Peptid- als auch HLA-DR-Bindung in Bindungsversuchen nachgewiesen werden konnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass eine effizientere Antigenpräsentation durch Hsp70:Peptid-Komplexe nicht von einer vermehrten Aufnahme der Komplexe sondern durch eine effektivere Antigenprozessierung in MHC II-Beladungskompartimenten ermöglicht wird.
Publications
- FOCIS 2011; 23.-26. Juni; Washington, D.C., USA: Uptake of Heat Shock Protein 70 - Peptide Complexes in Antigen-presenting Cells and their Interaction with MHC II Molecules
Schwoerer, D; von Manstein, V; Kalbacher, H.; Holzer, U.
