HPLC gekoppeltes Tandemmassenspektrometer - Teilantrag 2
Final Report Abstract
Proteine sind wichtige molekulare Akteure in lebenden Systemen da sie praktisch alle molekularen Vorgänge in Zellen steuern. Die Zahl z. B. menschlicher Proteine (das Proteom) ist enorm hoch. Aus den ca. 20.000 Genen des Menschen lassen sich gut 100.000 verschieden Proteine ableiten, die ihrerseits jeweils in vielfältiger Weise abgewandelt werden können und dadurch zu einer erstaunlichen molekularen Vielfalt führen, die für die große Zahl von Proteinfunktionen in allen Lebensformen notwendig ist. Die HPLC- gekoppelte Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) ist die derzeit wichtigste analytische Basistechnologie in der Proteomforschung da sie es erlaubt, tausende Proteine sowohl qualitativ als auch quantitativ in einem Experiment zu erfassen und somit z. B. die Veränderungen der Zusammensetzung von Proteomen in unterschiedlichsten physiologischen oder pathologischen Situationen zu analysieren. Die konkreten Aufgaben des geförderten LC-MS/MS Systems bestanden in der Hauptsache in: a) der Messung von komplexen aus enzymatischem Verdau von Geweben oder Zellkulturen gewonnenen Peptidgemischen zur Identifikation der in diesen Geweben oder Zellkulturen vorhanden Proteine. Hierbei wurde neben der chromatographischen Trennung der Peptide, die Elektrospray-Ionisierung sowie die stoßinduzierte Fragmentierung der Peptide im Gerät eingesetzt. Aus den erhaltenen Fragmentionenspektren lässt sich über computergestützte Verfahren auf die Aminosäuresequenz des Peptids und somit auf die Identität des Proteins rückschließen. b) der Quantifizierung von Proteinen aus ebendiesen komplexen Mischungen. Hierbei bedient man sich der Tatsache, dass das MS Signal eines Peptids ein relatives Maß für seine Menge ist. Hierzu wurden sowohl Methoden der Stabilisotopenmarkierung, als auch sogenannte markierungsfreie Verfahren angewandt. c) der Analyse von post-translationalen Proteinmodifikationen. Proteine werden in Zellen auch nach ihrer Synthese vielfältig molekular abgewandelt, was oftmals von entscheidender Bedeutung für die Funktion der Proteine ist. Mit diesen Modifikationen gehen zumeist Veränderungen der Masse des Proteins einher, weshalb sich die Massenspektrometrie besonders für diese Anwendung eignet. Konkret wurde mit dem geförderten Gerät die Modifizierung von Proteinen durch Phosphorylierung untersucht. d) der sogenannten „top-down“ Analyse von Proteinen aus menschlichem Gewebe. Bei diesem Verfahren, werden Proteine ohne enzymatische Spaltung per LC-MS/MS untersucht. Konkret wurde dieser Ansatz hier für die Identifikation von Kandidatenproteinen aus der bildgebenden Massenspektrometrie eingesetzt. Das LC-MS/MS System über das hier konkret berichtet wird, wurde und wird in einer Vielzahl von grundlegenden sowie angewandten Forschungsprojekten in den Lebenswissenschaften eingesetzt. Das Anwendungsspektrum reicht hier von der systematischen Analyse von Protein-Medikament Interaktionen bis zur Kartierung des Proteoms von Krebszellen und wie sich deren Proteinmuster auf das Ansprechen auf medikamentöse Therapie auswirkt. Beispielhaft sind im folgenden einige Arbeiten skizziert in denen das Gerät konkret eingesetzt wurde: 1. In Zusammenarbeit mit Forschern aus Heidelberg und Schweden konnte ein Verfahren entwickelt werden mit dessen Hilfe sich die Bindung einer chemischen Substanz (z. B. ein Medikament) an tausenden Proteinen gleichzeitig messen lässt. Hierbei wird ausgenutzt, dass eine derartige Bindung oftmals zu einer Hitzestabilisierung des Proteins führt welche sich mit der quantitativen Massenspektrometrie messen lässt. Auf diese Weise gelang es beispielsweise eine bis dato unerklärte Nebenwirkung eines Hautkrebsmedikamentes zu verstehen. 2. In Zusammenarbeit mit Pathologen der TU München gelang ein wichtiger technischer Fortschritt bei der Identifikation von Proteinen, die als Biomarkerkandidaten in der bildgebenden Massenspektrometrie (imaging mass spectrometry, IMS) aus menschlichen Gewebeproben stammen. Zum einen konnten wir durch die LC-MS/MS Analyse von enzymatisch verdauten Gewebeschnitten (Mensch und Maus) eine vollständige Sammlung aller potentiell durch die IMS zugänglichen Proteinbiomarker erzeugen. Zum anderen konnten wir durch den Einsatz der „top-down“ LC-MS/MS zeigen, dass viele Signale in der IMS Proteine darstellen, die durch körpereigene Proteasen prozessiert wurden sodass sich aus den Molekulargewichten allein meist nicht direkt auf das zugrundeliegende Protein schließen lässt. Durch den kombinierten Einsatz konnte eine wichtige technische Lücke weitgehend geschlossen werden. 3. Aufbauend auf der LC-MS/MS gestützten Kartierung der Proteome von 60 Krebszelllinien, die häufig in der Grundlagenforschung verwendet werden, gelang es die gefundenen Proteinmuster mit der Empfindlichkeit bzw. Resistenz der Krebszellen gegenüber Krebsmedikamenten zu korrelieren. Es zeigten sich vielerlei interessante Zusammenhänge was zukünftig möglicherweise erlauben wird, Proteinsignaturen von Krebszellen für die Therapieentscheidung oder die Messung des Therapieansprechens zu verwenden. 4. Eine Hauptanwendung des geförderten Gerätes lag in der Entwicklung und Anwendung eines Hochdurchsatzverfahrens, mit dem die Wechselwirkung einer bestimmten Form von Krebsmedikamenten (sogenannten Kinaseinhibitoren) mit tausenden von Proteinen in Krebszellen gleichzeitig und quantitativ gemessen werden kann. Insbesondere wurde hier ein markierungsfreier Ansatz gewählt, der es erlaubt, hunderte derartiger Experimente miteinander zu vergleichen. Im Ergebnis wurden dadurch wertvolle Informationen erhalten, die entweder neue Anwendungsmöglichkeiten dieser Medikamente erschließen, oder ein besseres Verständnis der Wirkungsweise bewirken oder Mechanismen zu möglichen toxischen Nebenwirkungen nahe legen.
Publications
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