The cytoplasmic localization and organization of the riboflavin biosynthetic enzymes in Bacillus subtilis and a possible role of the yet uncharacterized protein RibT in complex (FLAVINOSOME) formation/detoxification
Final Report Abstract
Im vorliegenden Projekt wurde beispielhaft die Lokalisation- bzw. die Anordnung von Biokatalysatoren (Enzymen) der Riboflavinbiosynthese im Bakterium Bacillus subtilis untersucht. Die biologisch wichtigen Cofaktoren FMN und FAD stellen dabei die aktiven Derivate des Riboflavins (Vitamin B2) dar. Die an der Synthese von Riboflavin beteiligten Enzyme heissen RibD (riboflavinspezifische Deaminase/Reduktase), RibE (Riboflavinsynthase), RibA (GTP Cyclohydrolase II/3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphatsynthase) und RibH (Lumazinsynthase). Entgegen der Arbeitshypothese, konnten wir nach Durchführung der geplanten Experimente, keinen Hinweis darauf finden, dass eine Komplexbildung der Enzyme RibA, RibE, RibH und RibD im Cytoplasma von B. subtilis erfolgt. Unsere jetzigen Daten, insbesondere die fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Proteinfusionen, deuten darauf hin dass die beteiligten Enzyme frei verteilt im Cytoplasma liegen und dass der Stoffaustausch folglich allein durch Diffusion erfolgt. Ein weiteres Ziel der Arbeit war die Funktion des Proteins RibT aufzuklären. Wir konnten mittels Metabolomstudien zeigen, dass dieses Protein weder niedermolekulare Metabolite noch Proteine modifiziert. Eine mögliche physiologische Aufgabe bei der Bildung eines Enzymkomplexes („Flavinosom“) bzw. bei der Entgiftung konnte nicht nachgewiesen werden. In vivo Interaktionsstudien zeigten vielmehr, dass RibT mit sich selbst und mit den Enzymen der Riboflavinbiosynthese RibH und RibE interagiert. Die Inaktivierung des dazugehörigen Gens ribT führt zu einem interessanten Phänotyp, weniger Riboflavin wird in einem solchen „knock-out“-Stamm gebildet. Damit konnten wir eindeutig zeigen, dass RibT tatsächlich die Riboflavinsynthese beeinflusst. Dies ist durchaus plausibel, denn das dazugehörige Gen liegt am Ende des Riboflavinoperons ribDEAH und wird mit diesen Genen auch cotranskribiert. Der exakte molekulare Mechanismus von RibT wird z. Z. noch weiter untersucht. Die zur Messung von Protein-Protein-Interaktionen verwendeten und in der Literatur beschriebenen Techniken „SPINE“ und „TAP“ erwiesen sich für unsere Fragestellung als ungeeignet. Mit diesen Techniken können starke Interaktionen zwischen Proteinen bestimmt bzw. gemessen werden, was wir anhand der durchgeführten Kontrollen auch eindeutig zeigen konnten. Für den Nachweis schwacher Wechselwirkungen sind diese Techniken nicht geeignet. Wir gehen nach wie vor davon aus, dass Enzyme auch in einer prokaryontischen Zelle miteinander interagieren. Allerdings sind diese Wechselwirkungen zu schwach, um eine Proteinreinigung (siehe „SPINE“ und „TAP“) zu überstehen. Sehr wahrscheinlich dürfen diese Wechselwirkungen zwischen Enzymen auch nicht zu stark sein, denn ansonsten wären die Dynamik und Katalyseeigenschaften eines Proteins zu stark beeinflusst.
Publications
- A novel N,N-8-amino-8-demethyl-D-riboflavin Dimethyltransferase (RosA) catalyzing the two terminal steps of roseoflavin biosynthesis in Streptomyces davawensis. J Biol Chem. 2011 Nov 4;286(44):38275-85
Jankowitsch F, Kühm C, Kellner R, Kalinowski J, Pelzer S, Macheroux P, Mack M
